李志萍，張文輝，崔豫川

天津師范大學(xué), 生命科學(xué)學(xué)院, 天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300387

NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

李志萍，張文輝*，崔豫川

天津師范大學(xué), 生命科學(xué)學(xué)院, 天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300387

為了闡明栓皮櫟種子萌發(fā)期對鹽堿脅迫的耐受性，研究了不同濃度(0、 50、100、200和400 mmol/L) NaCl和Na2CO3脅迫對其種子萌發(fā)、生長、保護(hù)酶活性和有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等的影響，結(jié)果表明：(1)鹽堿脅迫對栓皮櫟種子的萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)均沒有顯著影響；隨著Na+濃度的升高，NaCl和Na2CO3處理下的胚根長度、胚根生長速率、胚根鮮重均受到抑制，呈現(xiàn)下降趨勢；活力指數(shù)和耐鹽指數(shù)在NaCl脅迫下表現(xiàn)為較低濃度(50 mmol/L)促進(jìn)，較高濃度(100, 200, 400 mmol/L)抑制，而在Na2CO3處理下則不斷下降；相對鹽害率在兩種處理下均表現(xiàn)波動趨勢。(2)通過建立活力指數(shù)、胚根長度等與Na+濃度的回歸方程，發(fā)現(xiàn)在NaCl脅迫下栓皮櫟種子活力指數(shù)、胚根鮮重、胚根長度和胚根生長速率的臨界值分別為300.0、300.0、333.6、369.6 mmol/L。(3)在NaCl和Na2CO3脅迫下，隨Na+濃度的增加，丙二醛含量增幅顯著；NaCl處理下的SOD(superoxide dismutase)活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而Na2CO3處理下則均低于對照；POD(peroxidase)活性變化不顯著；CAT(catalase)活性均表現(xiàn)為先降低后升高；脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量均隨著Na+濃度的升高而呈現(xiàn)不同程度上升趨勢。(4)等Na+濃度時(shí)，NaCl處理下的各項(xiàng)生長指標(biāo)均高于Na2CO3處理，丙二醛、保護(hù)酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均低于Na2CO3處理，說明Na2CO3對栓皮櫟種子的影響比NaCl更為顯著。

栓皮櫟; 種子; 萌發(fā); 鹽堿脅迫; 保護(hù)酶

土壤的鹽堿化治理已成為全球范圍內(nèi)迫切需要解決的重大課題。近年來，人們開始由排鹽工程治理轉(zhuǎn)向了篩選耐鹽植物的生物治理。天津位于渤海之濱，在鹽堿地上開展綠化一直是困擾天津城市建設(shè)的難題。近年來，天津市濱海地區(qū)投入大量的人力、物力、財(cái)力進(jìn)行園林綠化建設(shè)，但是在實(shí)施土壤改良、排鹽技術(shù)處理等項(xiàng)目過程中有時(shí)不能達(dá)到預(yù)期效果，導(dǎo)致植物死亡，造成不必要的損失[1]。因此篩選具有較強(qiáng)耐鹽堿能力的園林植物向天津引種顯得尤為迫切。

栓皮櫟(Quercusvariabilis)是我國重要的造林樹種之一，其木材、樹皮、果實(shí)及葉等均有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；栓皮櫟林是組成我國落葉闊葉林的一個(gè)基本群系，同時(shí)對保持水土、涵養(yǎng)水源、增加土壤肥力等方面均有重要意義[2]。將栓皮櫟引種到天津地區(qū)作為園林植物栽培，不僅可以在綠化、美化環(huán)境中發(fā)揮作用，而且可以通過軟木、栲膠原料生產(chǎn)，為地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。目前對栓皮櫟的研究內(nèi)容主要集中于生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特性、種群生態(tài)、資源培育以及綜合利用方面[3]，關(guān)于其對鹽漬化土壤適應(yīng)性方面實(shí)驗(yàn)研究很少。2008年將栓皮櫟幼苗引入到天津市區(qū)，在不同干旱、鹽漬化土壤上栽植，觀測其園林特性，發(fā)現(xiàn)其對干旱、鹽漬化土壤具有一定適應(yīng)性[4- 5]，然而關(guān)于栓皮櫟種子耐鹽堿方面的研究還未見報(bào)道。

種子萌發(fā)期是植物生活史中最脆弱的階段，也是進(jìn)行抗逆性研究的重要時(shí)期。近年來，國內(nèi)外有關(guān)鹽堿脅迫對種子萌發(fā)影響的研究越來越多[6- 7]，但是缺乏統(tǒng)一的衡量指標(biāo)，且研究多集中在NaCl脅迫，而對NaHCO3、Na2CO3脅迫涉及相對較少，在某種程度上可能脫離了植物生境的實(shí)際情況[8- 9]。由于天津地區(qū)鹽漬化土壤主要由以NaCl為主的中性鹽和以Na2CO3為主的堿性鹽組成[10]，且栓皮櫟主要通過種子繁殖[11]，因此研究栓皮櫟種子在鹽堿條件下的萌發(fā)和生長對其作為園林植物引種到天津具有重要指導(dǎo)意義。

本研究在控制試驗(yàn)條件下，模擬不同NaCl和Na2CO3脅迫條件(0、 50、 100、 200和 400 mmol/L)，采用培養(yǎng)皿濾紙萌發(fā)的方法探討鹽堿脅迫對栓皮櫟種子萌發(fā)、生長及保護(hù)酶系統(tǒng)等的影響，為栓皮櫟種子萌發(fā)期的耐鹽堿特性提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用種子采自栓皮櫟分布中心秦嶺北坡，周至縣樓觀臺林場。2012 年10 月份采摘種子后水選法去除空粒和夾雜物，經(jīng)表面陰干后加入磷化鋁包裝寄運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

種子大小、重量及活力的測定：1)種子千粒重的測定以1000 ?！? 組的平均值為其平均重量(±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。2)種子大小以毫米紙為標(biāo)準(zhǔn)，測定20 粒種子的長軸和短軸，求平均值。3)將種子切成薄片，80 ℃烘干至恒重，測定含水量。4)活力測定是按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB2772- 81《林木種子檢驗(yàn)方法》，從供試樣品中隨機(jī)取出50 粒種子通過TTC法測定活力[12]，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

經(jīng)檢測，實(shí)驗(yàn)用栓皮櫟種子直徑(15.59±2.23) mm，長(21.07±1.43) mm，千粒重(3720±109) g。新鮮栓皮櫟種子含水量為75.51%，種子活力在90%以上。選取飽滿、大小均勻的種子備用。

1.2 種子培養(yǎng)及脅迫處理

(1)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)[13- 15]配制溶液

NaCl溶液：用NaCl配成Na+濃度依次為50, 100, 200, 400 mmol/L的溶液，相應(yīng)pH值均為6.6(用 NaOH溶液調(diào)配)；

Na2CO3溶液：用Na2CO3配成Na+濃度分別為50, 100, 200, 400 mmol/L的溶液，相應(yīng)pH值為8.9，11.6，11.8 和11.9。

(2)2012 年12 月15 日開始種子萌發(fā)脅迫實(shí)驗(yàn)

選取大小均一、成熟飽滿的栓皮櫟種子，用自來水沖干凈，經(jīng)0.1%HgCl2消毒10 min，蒸餾水沖洗3 次。吸水紙吸干種子表面水分后，將種子播種于置入2 層紗布和1 層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑12 cm)中，每一發(fā)芽床擺放20 粒種子。實(shí)驗(yàn)設(shè)NaCl和Na2CO32 個(gè)處理，每個(gè)處理4 個(gè)梯度水平，每個(gè)水平3 次重復(fù)。NaCl處理下每皿分別移入10 mL不同濃度的NaCl溶液，Na2CO3處理分別移入10 mL不同濃度Na2CO3溶液，使濾紙飽和，用蒸餾水作對照。蓋上玻璃蓋，以防止溶液蒸發(fā)，2d更換1次發(fā)芽床。將培養(yǎng)皿置于SPX- 150B-Z型生化培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫25 ℃，相對濕度60%，連續(xù)黑暗培養(yǎng)10 d。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長指標(biāo)測定

以種子露白作為發(fā)芽標(biāo)志，每天定時(shí)觀察、記錄種子萌發(fā)數(shù)，測量胚根長度。種子萌發(fā)的時(shí)限按國際種子檢驗(yàn)規(guī)程規(guī)定發(fā)芽天數(shù)為10 d[16]。由于10 d之內(nèi)并未出現(xiàn)胚軸及子葉，發(fā)芽結(jié)束后測定全部胚根鮮重：

萌發(fā)率G=n/N×100%

式中，n為萌發(fā)種子數(shù)，N為供試種子數(shù)[17]。

發(fā)芽指數(shù)Gi= ∑(Gt/Dt)

式中，Gt為時(shí)間t日的萌發(fā)數(shù)，Dt為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù)。

活力指數(shù)Iv=S×Gi

式中，s為胚根鮮重[18]。

生長速率 =L/∑[Ni×(Dt-Di+ 0.5)]

式中，L指每一皿中全部萌發(fā)種子胚根或胚軸長度的總和；Ni指第i天的萌發(fā)種子數(shù)；Dt指實(shí)驗(yàn)持續(xù)的天數(shù)(10 d)，Di指第i天[19]。

耐鹽指數(shù)=VIv鹽 /VIv水×100

式中,VIv鹽為鹽脅迫下的萌發(fā)活力指數(shù)，VIv水為對照下的萌發(fā)活力指數(shù)[20]。

相對鹽害率[9]

RSH= (對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率) / 對照萌發(fā)率×100%

耐鹽臨界值：先對相應(yīng)指標(biāo)和Na+脅迫濃度進(jìn)行相關(guān)分析，若兩者存在相關(guān)性，則進(jìn)行回歸分析，根據(jù)回歸方程求出耐鹽臨界值。耐鹽臨界值為與鹽堿脅迫強(qiáng)度呈正相關(guān)的指標(biāo)增加到對照的200%時(shí)所對應(yīng)的濃度，或者與鹽堿脅迫強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)降低到對照的50%時(shí)所對應(yīng)的濃度[21]。

1.3.2 生理指標(biāo)測定

保護(hù)酶酶液的提?。捍l(fā)芽結(jié)束后，取每培養(yǎng)皿中發(fā)芽種子的胚根0.1 g，置于預(yù)冷的研缽中，加適量預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液(含1% 聚乙烯吡咯烷酮，pH值 7)及少量石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，在2—4 ℃下，12000 r/min離心20 min。上清液為酶液。

SOD(superoxide dismutase)的測定參照李合生[22]的方法，以抑制氯化硝基四氮唑藍(lán)光化還原50%為一個(gè)酶活性單位表示。CAT(catalase)的測定用紫外吸收法，以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為一個(gè)酶活性單位[23]。POD(peroxidase)的測定用愈創(chuàng)木酚染色法，以每1 min內(nèi)A470變化0.01為一個(gè)過氧化物酶活性單位[24- 35]?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮蘭染色法[22]測定。

丙二醛和可溶性糖含量采用硫代巴比妥酸法測定[26]：取每培養(yǎng)皿發(fā)芽種子胚根0.1 g，加入10% TCA(三氯乙酸)迅速研磨，離心后，取上清和10%TCA各2 mL于另一空離心管中，加蓋煮沸15 min，冷卻后再次離心，測定吸光值。脯氨酸含量測定：取每培養(yǎng)皿發(fā)芽種子胚根0.1 g，加入3%磺基水楊酸溶液研磨，將勻漿液全部轉(zhuǎn)入到離心管中，沸水浴10 min，冷卻離心后吸取上清液即為脯氨酸的提取液，采用茚三酮顯色法[22]測定含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，并在置信水平95%上用Duncan方法進(jìn)行多重比較，每一指標(biāo)的圖或表均為3次重復(fù)求平均值，然后利用Excel2003繪制而成。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子萌發(fā)的影響

2.1.1 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子總萌發(fā)率的影響

圖1 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子總萌發(fā)率的影響 Fig.1 Effect of NaCl and Na2CO3 stresses on total germination 不同字母表示相同處理不同Na+濃度在P<0.05水平上差異顯著

如圖1所示，脅迫結(jié)束(10 d)后，兩種處理下的萌發(fā)率均呈現(xiàn)波動趨勢。對照的萌發(fā)率為75%，50和200 mmol/L Na+濃度下，NaCl和Na2CO3脅迫處理的萌發(fā)率均高于對照，且50 mmol/L NaCl脅迫下萌發(fā)率達(dá)到最大值(85%)；100和400 mmol/L濃度下兩者的萌發(fā)率均低于對照，在100 mmol/L Na2CO3脅迫下，萌發(fā)率達(dá)到最低(62%)。進(jìn)行單因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，兩種處理對種子萌發(fā)率均沒有顯著影響。除對照之外，相同Na+濃度條件下，NaCl的萌發(fā)率總是高于Na2CO3，說明Na2CO3對種子發(fā)芽的影響較NaCl高。

2.1.2 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子發(fā)芽指數(shù)的影響

發(fā)芽指數(shù)綜合種子萌發(fā)的數(shù)目、速度以及整齊度3個(gè)因素，比單純的發(fā)芽率更能全面地反映種子的萌發(fā)情況[27]。如圖2所示，50和100 mmol/L NaCl處理下種子的發(fā)芽指數(shù)分別是對照的1.08和1.05倍，之后隨著處理濃度的升高發(fā)芽指數(shù)降低，400 mmol/L時(shí)只降到對照的93.7%。而在Na2CO3脅迫下，各處理濃度的發(fā)芽指數(shù)呈波動趨勢且均低于對照。100 mmol/L處理下達(dá)到最低值，僅為對照的72.2%；200 mmol/L處理下達(dá)到對照的96.0%。進(jìn)行單因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，兩種處理對種子發(fā)芽指數(shù)均沒有顯著影響。相同Na+濃度條件下，NaCl的發(fā)芽指數(shù)總是高于Na2CO3，說明Na2CO3對種子的傷害較NaCl高，導(dǎo)致種子萌發(fā)數(shù)目及速度均受到較大影響。

圖2 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子發(fā)芽指數(shù)的影響 Fig.2 Effects of NaCl and Na2CO3 stresses on germination index

2.2 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子生長的影響

2.2.1 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子胚根生長的影響

種子萌發(fā)后，胚根的延伸可以反映出植物定居成苗的特性。從表1中可以看出，脅迫結(jié)束(10 d)后，NaCl處理下胚根長度、胚根生長速率和胚根鮮重均隨Na+濃度增加呈下降趨勢，在400 mmol/L濃度時(shí)下降到最低，分別為對照的45.4%、44.4%、30.6%，且與對照差異顯著。Na2CO3脅迫下胚根長度、胚根生長速率和胚根鮮重呈波動下降趨勢，且均低于對照，400 mmol/L Na2CO3脅迫下分別下降為對照的32.6%、41.7%、23.4%。相同Na+濃度條件下，NaCl處理下的胚根長度、胚根生長速率和胚根鮮重均大于Na2CO3，說明Na2CO3脅迫對種子胚根生長的影響更為嚴(yán)重。與對照相比，400 mmol/L NaCl脅迫下栓皮櫟種子生長受到抑制，且胚根尖端變黑；而在同濃度Na2CO3脅迫下不僅胚根尖端變黑，種子本身也明顯發(fā)黑(圖3)。

表1 不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子胚根長度、胚根生長速率和胚根鮮重的影響Table 1 Effects of different concentrations of NaCl and Na2CO3 on the length, growth rate and fresh weight of radicle

圖3 萌發(fā)5 d后對照及400 mmol/L NaCl和Na2CO3脅迫處理下的栓皮櫟種子Fig.3 The seeds under CK and 400 mmol/L NaCl and Na2CO3 stress after five days

通過相關(guān)分析及建立鹽堿脅迫濃度與各指標(biāo)之間的回歸方程，發(fā)現(xiàn)栓皮櫟種子胚根鮮重、胚根長度、胚根生長速率與鹽堿脅迫具有顯著相關(guān)關(guān)系，且NaCl脅迫下胚根鮮重、胚根長度和胚根生長速率的臨界值分別為300.0、333.6、369.6 mmol/L；Na2CO3脅迫下其臨界值分別為67.2、182.0、187.5 mmol/L(表2)。

表2 栓皮櫟種子胚根生長、活力指數(shù)等與鹽堿脅迫的相關(guān)系數(shù)及回歸方程Table 2 The relationship and regression equation between radicle growth, vigor index and different concentrations of Na+

2.2.2 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子活力指數(shù)的影響

種子活力比常規(guī)發(fā)芽率的測定更能反映種子在實(shí)際條件下萌發(fā)速度和整齊度以及幼苗健壯生長的潛勢[28]。如圖4所示，NaCl脅迫下種子的活力指數(shù)在50 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，是對照的1.17倍。100—400 mmol/L濃度下活力指數(shù)不斷下降，400 mmol/L時(shí)下降到最低，與對照差異顯著。而在Na2CO3處理下種子活力指數(shù)均低于對照，且差異顯著，400 mmol/L下降到最低值，僅為對照的19.3%。相同Na+濃度條件下，NaCl的活力指數(shù)總是高于Na2CO3，說明Na2CO3處理對種子活力的抑制作用大于NaCl。建立兩種脅迫條件下活力指數(shù)與Na+濃度的回歸方程，發(fā)現(xiàn)其在NaCl和Na2CO3脅迫下的臨界值分別為300.0、69.0 mmol/L(表2)。

2.2.3 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子耐鹽指數(shù)和相對鹽害率的影響

相對鹽害率反映栓皮櫟種子受脅迫的傷害程度，耐鹽指數(shù)反映其對鹽堿脅迫的耐受程度。從表3中看出，NaCl脅迫下，400 mmol/L時(shí)相對鹽害率達(dá)到最大值，而在50和200 mmol/L下的種子并未受到毒害，反而表現(xiàn)為萌發(fā)受到促進(jìn)；Na2CO3處理下，100 mmol/L時(shí)相對鹽害率達(dá)到最大，而50 mmol/L下表現(xiàn)為促進(jìn)。NaCl脅迫下種子的耐鹽指數(shù)在50 mmol/L處理下達(dá)到最大值，是對照的1.17倍。100—400 mmol/L濃度下耐鹽指數(shù)不斷下降，在400 mmol/L下降到最低，且與對照差異顯著。而在Na2CO3處理下種子耐鹽指數(shù)均低于對照，400 mmol/L下降到最低值，僅為對照的19.3%。相同Na+濃度條件下，NaCl的耐鹽指數(shù)和相對鹽害率總是高于Na2CO3，說明Na2CO3處理對種子活力的毒害作用大于NaCl。

圖4 不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子活力指數(shù)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NaCl and Na2CO3 on the seed vigor index

表3 不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子耐鹽指數(shù)和相對鹽害率的影響

Table 3 Effects of different concentrations of NaCl and Na2CO3on salt tolerance index and relative salt-harmed rate

2.3 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子生理特性的影響

2.3.1 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子丙二醛含量及保護(hù)酶活性的影響

圖5 不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子丙二醛含量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NaCl and Na2CO3 on the MDA (malondialdehyde) contents in seeds

在植物抗逆性實(shí)驗(yàn)中，通常用丙二醛(MDA)的含量變化來衡量脂質(zhì)過氧化程度[29]。隨Na+濃度的升高，兩種處理下的MDA含量均呈現(xiàn)升高趨勢，但升高幅度不同，且Na2CO3脅迫下的MDA含量均高于NaCl(圖5)，可見Na2CO3脅迫下栓皮櫟種子的膜脂過氧化程度較大。

在NaCl脅迫下，SOD活性在50—200 mmol/L時(shí)均高于對照，但與對照無顯著差異，而400 mmol/L時(shí)顯著低于對照。在Na2CO3脅迫下，SOD活性均低于對照(圖6)，且與對照差異顯著。NaCl處理下的SOD活性是相同濃度Na2CO3處理的1.01—1.03倍，說明SOD對堿脅迫較敏感。

兩種處理下POD活性均呈現(xiàn)波動趨勢，且彼此間均無顯著影響(圖6)。等Na+濃度下， Na2CO3處理下的POD活性均高于NaCl，說明NaCl對POD活性的抑制程度大于Na2CO3。

CAT活性在NaCl和Na2CO3脅迫下均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。兩種處理下的CAT活性均在50 mmol/L下達(dá)到最低值，分別為對照的76.8%、93.1%，之后不斷升高，NaCl處理在400 mmol/L 時(shí)達(dá)到最大值，Na2CO3脅迫在200 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值(圖6)。等Na+濃度下，Na2CO3處理下的CAT活性均高于NaCl，說明CAT活性對鹽脅迫敏感度低于堿脅迫。

圖6 不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子SOD 、POD、CAT活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NaCl and Na2CO3 on the SOD(superoxide dismutase)，POD(peroxidase) and CAT(catalase) activities in seeds

2.3.2 NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性蛋白含量在兩種脅迫下均呈現(xiàn)升高趨勢，在400 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，分別比對照增加33.1%、68.5%(圖7)。Na2CO3處理下的可溶性蛋白含量是相同濃度NaCl處理的1.26—1.88倍，說明堿脅迫下栓皮櫟種子受到更大的滲透脅迫。

圖7 不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.7 Effects of different concentrations of NaCl and Na2CO3 on the soluble protein，soluble sugar and proline contents in seeds

0—200 mmol/L NaCl脅迫條件下，脯氨酸含量基本保持不變，400 mmol/L時(shí)迅速增加到對照的1.18倍。Na2CO3處理下的脯氨酸含量曲折上升，在0—200 mmol/L時(shí)均高于同濃度NaCl處理，200 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，400 mmol/L時(shí)有所下降，且低于同濃度NaCl(圖7)?？梢?，脯氨酸對Na2CO3和高濃度(400 mmol/L)NaCl處理較為敏感。

可溶性糖在不同濃度NaCl和Na2CO3脅迫下呈現(xiàn)曲折升高的趨勢。兩種處理分別在400 mmol/L和100 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值，分別為對照的1.68、2.18倍(圖7)。同等Na+濃度下，Na2CO3處理下的可溶性糖含量均高于NaCl，說明堿脅迫下栓皮櫟需要更多的可溶性糖來調(diào)節(jié)滲透壓。

3 討論

50 mmol/L NaCl處理下種子的萌發(fā)率、活力指數(shù)和耐鹽指數(shù)均比對照高，相對鹽害率表現(xiàn)為促進(jìn)作用，這與邱念偉等[30]對伽藍(lán)菜和堿蓬、毛培春等人[20,31- 32]的研究結(jié)果相似，可能與低濃度鹽促進(jìn)細(xì)胞膜滲透調(diào)節(jié)有關(guān)，也可能是微量的Na+對呼吸酶有一定的激活作用[33]。即使鹽堿濃度較高(200 mmol/L)，種子萌發(fā)率仍高于對照，可能是栓皮櫟種子較大，其本身具有較高的含水量引起的。Na2CO3脅迫下，種子發(fā)芽指數(shù)均受到抑制，而200 mmol/L 條件下發(fā)芽指數(shù)較高，可能此時(shí)脯氨酸和可溶性蛋白含量增加、CAT活性增強(qiáng)，使種子發(fā)芽受抑制程度降低，或者是Na+、Cl-參與了無機(jī)滲透調(diào)節(jié)[34]，這有待于進(jìn)一步研究。等Na+濃度時(shí)，Na2CO3脅迫下萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和耐鹽指數(shù)均小于NaCl，說明堿脅迫比鹽脅迫具有更大的傷害力[35- 36]。

NaCl脅迫條件下的胚根生長和胚根生長速率受到抑制，即隨著Na+濃度的增加而顯著下降；Na2CO3脅迫下胚根生長嚴(yán)重受阻，這可能和細(xì)胞內(nèi)激素調(diào)節(jié)有關(guān)[37]，200 mmol/L脅迫條件下卻高于100 mmol/L，可能較高且適宜的濃度脅迫仍然對種子生長有刺激作用，這與竇聲云等[38]對老芒麥的研究結(jié)果類似。50 mmol/L NaCl處理下的胚根鮮重高于對照，可能較低濃度的脅迫可以刺激同化物更多向根系分配，促使根系的分枝和下扎[39]。Na+濃度相同時(shí)，Na2CO3脅迫下的胚根長度、胚根生長速率、胚根鮮重均低于NaCl脅迫，因?yàn)閴A性鹽脅迫下除了Na+作用外還增加高pH的作用[40]。

根據(jù)耐鹽臨界值的比較分析可以發(fā)現(xiàn)，活力指數(shù)和胚根鮮重對鹽脅迫較為敏感，其次為胚根長度，胚根生長速率最不敏感。由于胚根鮮重受到最為強(qiáng)烈的抑制，因此，由胚根長度得到的耐鹽臨界值(最小耐鹽臨界值)最能反映種子萌發(fā)期的耐鹽性，在鹽堿脅迫下其最小臨界值分別為333.6、182.0 mmol/L。

在脅迫條件下，植物因鹽堿傷害而使細(xì)胞膜受到損傷，產(chǎn)生大量的MDA，膜受傷害又產(chǎn)生大量自由基[41]；此時(shí)植物的保護(hù)酶系統(tǒng)被激活。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個(gè)重要保護(hù)酶，它們發(fā)揮協(xié)同作用，消除活性氧，保護(hù)植物膜系統(tǒng)[42]。本研究中，栓皮櫟種子在低濃度NaCl(50 mmol/L)脅迫下，主要是SOD起作用，這與寇賀等[43]對大豆(Glycinemax)種子萌發(fā)的研究結(jié)果相似；而在Na2CO3和高濃度NaCl脅迫下SOD活性降低，可能是其調(diào)節(jié)能力有限，酶結(jié)構(gòu)遭受破壞導(dǎo)致體內(nèi)積累了過量的活性氧氧自由基，這些自由基又引起膜過氧化，產(chǎn)生大量MDA。CAT和POD在兩種脅迫下并未受到傷害導(dǎo)致活性降低，而是在波動范圍內(nèi)保持正?；钚詠砬宄踝杂苫?。等Na+濃度，NaCl處理下的SOD活性均高于Na2CO3，Na2CO3處理下的POD和CAT活性均高于NaCl。由此推測NaCl處理下主要靠SOD清除自由基，Na2CO3處理下主要靠POD和CAT活性來維持植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡，可能是栓皮櫟種子保護(hù)酶活性在鹽堿脅迫下的調(diào)控機(jī)制不同，這有待于進(jìn)一步研究。

在鹽堿脅迫下，細(xì)胞會發(fā)生滲透脅迫，植物通過增加體內(nèi)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來降低細(xì)胞內(nèi)滲透勢，提高自身耐受性。本研究中，兩種處理下的可溶性蛋白含量均上升，可能栓皮櫟種子經(jīng)鹽堿脅迫后產(chǎn)生較多的有害物質(zhì)，需要合成較多的酶類物質(zhì)以清除這些有害物質(zhì)[13]。在高濃度NaCl(400 mmol/L)脅迫下脯氨酸含量的顯著增加，可降低細(xì)胞滲透勢，緩解滲透脅迫對植物生長的抑制作用；而在Na2CO3脅迫下增幅不顯著，可能是Na2CO3抑制了脯氨酸合成酶系[44]。兩種脅迫下可溶性糖含量均升高，其含量增加可提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力。等Na+濃度下，Na2CO3處理下的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量均高于NaCl。這是由于植物在堿脅迫下除了要承受與鹽脅迫相同的滲透脅迫與離子傷害，還要抵御高pH值脅迫。已經(jīng)有研究表明，以Na2CO3為主要鹽分的堿脅迫對植物生長發(fā)育的危害遠(yuǎn)大于NaCl為主的鹽脅迫[45- 47]，在本研究中也得到了證實(shí)。

綜上所述，在鹽堿脅迫下，栓皮櫟種子通過提高自身保護(hù)酶活性、增加體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等來抵抗逆境，降低鹽堿脅迫對種子萌發(fā)及生長的傷害?？梢姡ㄆ翟诜N子萌發(fā)期具有一定的抗鹽堿能力，但本研究不能完全代表大田育苗的實(shí)際情況，還有待于進(jìn)一步進(jìn)行大田出苗期耐鹽堿實(shí)驗(yàn)，使其在天津等鹽堿地區(qū)大面積廣泛種植。

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Effects of NaCl and Na2CO3stresses on seed germination and seedling growth ofQuercusvariabilis

LI Zhiping, ZHANG Wenhui*, CUI Yuchuan

TianjinKeyLaboratoryofAnimalandPlantResistance,CollegeofLifeSciences,TianjinNormalUniversity,Tianjin300387,China

Choosing fresh cork oak seeds and using Petri dish and filter paper germination method, the NaCl and Na2CO3resistant potential ofQuercusvariabilisseeds with five different NaCl and Na2CO3concentrations (0, 50, 100, 200 and 400 mmol/L) were examined.During the experimental process, the seed germination, radicle growth, three protective enzyme (SOD, POD, CAT) activities and the organic osmoregulation substances (proline, soluble protein and soluble sugar) were all measured, and the correlation between the seed germination, radicle growth rate under NaCl and Na2CO3stress were analysed.The results showed that: (1) NaCl and Na2CO3stress had no significant impact to seed germination rate and germination index, even under high Na+concentration (200 mmol/L) stress, seed germination rate was still higher than contrast.With the addition of Na+concentration, radicle length, radicle growth rate and fresh weight of radicle under two kinds of stresses presented the downward trend.The vigor index and salt tolerance index under NaCl stress increased at the lower concentrations (50 mmol/L) and then decreased at the higher concentrations (100, 200 and 400 mmol/L), but they both declined under Na2CO3treatment.Relative salt-harmed rate waved under two stresses, they were lower than the contrast under 50 and 200 mmol/L Na+concentration, but were higher under 100 and 400 mmol/L Na+concentration.(2) The regression equation between vigor index, radicle growth rate and different concentrations of NaCl and Na2CO3stress were found, and they showed that the critical value of the vigor index, fresh weight of radicle, radicle length and radicle growth rate under NaCl stress, were 300.0, 300.0, 333.6 and 369.6 mmol/L respectively, they were 69.0, 67.2, 182.0, 187.5 mmol/L respectively under Na2CO3stress.(3) Under two kinds of stresses, with the increase of Na+concentration, MDA (malondialdehyde) content increased significantly; SOD (superoxide dismutase) activity decreased after increasing under NaCl treatment, but they were all lower than the contrast under Na2CO3treatment; POD (peroxidase) activity had no significant change, CAT (catalase) activity was down and then rose.Proline, soluble protein and soluble sugar contents were increased in varying degrees with the addition of Na+concentration, they were to the maximum under the largest concentration of NaCl treatment, and they were all higher than the contrast under Na2CO3treatment (4) Under the same Na+concentration stress, the growth indicators such as seed germination rate, germination index, radicle length, radicle growth rate and fresh weight of radicle under NaCl treatment were all higher than that of Na2CO3treatment, malondialdehyde, protective enzymes (SOD, POD, CAT) activities and osmotic adjustment substances (proline, soluble protein and soluble sugar) contents were all lower than that of Na2CO3treatment, which showed the effects of Na2CO3stress on seeds were more significant than that of NaCl stress.Thus it can be seen that cork oak seeds increased protective enzymes activities and contents of osmotic regulation substances in vivo to adapt to the salt-alkali stress, making the inhibition degree of germination and growth to the minimum.

Quercusvariabilis; seed; germination; salt and alkali tolerance; protective enzyme

國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)專項(xiàng)(201104011); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30872018)

2013- 04- 19;

日期:2014- 04- 03

10.5846/stxb201304190747

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zwhckh@163.com

李志萍，張文輝，崔豫川.NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子萌發(fā)及幼苗生長的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(3):742- 751.

Li Z P, Zhang W H, Cui Y C.Effects of NaCl and Na2CO3stresses on seed germination and seedling growth ofQuercusvariabilis.Acta Ecologica Sinica,2015,35(3):742- 751.