張彥榮，王志波，畢偉，張文濤，呂璐

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050000;2河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院; 3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院)

骨骼肌缺血再灌注損傷在臨床上很常見，再灌注損傷不僅可以導(dǎo)致局部組織第二次打擊，還能導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官(如腎、肺等)的繼發(fā)性的損傷［1］。細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)屬免疫球蛋白超家族成員，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及中性粒細(xì)胞穿過血管壁的過程，是缺血再灌注損傷中的重要的炎性介質(zhì)，可激活一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生大量的一氧化氮(NO)，造成組織損傷［2］。氨基胍(AG)是iNOS的抑制劑，研究表明，AG主要通過抑制iNOS的活性進(jìn)而減少NO的產(chǎn)生而起作用［3］。2013年1～5月本實(shí)驗(yàn)采用AG進(jìn)行治療，通過觀察ICAM-1、NO的變化及肺組織損傷情況，進(jìn)一步探求AG在骨骼肌缺血再灌注肺損傷中作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wister大鼠24只，體質(zhì)量200 g左右，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。AG購(gòu)自Sigma公司，ICAM-1免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，NO、乳酸脫氫酶(LDH)、髓過氧化物酶(mpo)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物工程有限公司，Trlzol RNA提取試劑Invitrogen公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制劑、dNTP、Taq DNA聚合酶、隨機(jī)引物及瓊脂糖均為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品;熒光定量試劑盒購(gòu)自BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將24只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，Ⅰ組為對(duì)照組，僅進(jìn)行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流(10 h后取材);Ⅱ組為缺血組，即阻斷后肢動(dòng)脈致缺血4 h，不行再灌注;Ⅲ組為I/R組，即阻斷后肢動(dòng)脈致缺血4 h再灌注6 h;Ⅳ組為I/R+AG組，即阻斷后肢動(dòng)脈致缺血4 h再灌注6 h，再灌注開始時(shí)經(jīng)尾靜脈注射AG注射液(150 mg/kg)［4］。

1.2.2 模型制備方法 20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，止血帶捆扎兩側(cè)大腿根部，使兩后肢缺血4 h后去除止血帶實(shí)現(xiàn)再灌注［5］，各組設(shè)定時(shí)間處理動(dòng)物，分別取材。

1.2.3 血清LDH、NO及肺組織MPO檢測(cè) 各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)經(jīng)心臟穿刺取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDH含量，用Bio Tek ELX800酶標(biāo)儀嚴(yán)格按照NO檢測(cè)試劑盒進(jìn)行NO檢測(cè)，取肺組織勻漿并用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺組織中MPO含量。

1.2.4 肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 對(duì)4組肺組織進(jìn)行免疫組化染色，肺泡上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。ICAM-1陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［6］。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，按照染色強(qiáng)度計(jì)分:0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色;按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分:無陽性細(xì)胞計(jì)0分，≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞76%計(jì)4分;二者計(jì)分相乘0～2分為(－)，≥3分為(+)。

1.2.5 肺組織ICAM-1基因表達(dá)檢測(cè) 采用RTPCR法檢測(cè) 4組肺組織 ICAM-1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清LDH、NO及肺組織MPO比較 見表1。

表1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDO比較(s)

表1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDO比較(s)

注:與Ⅰ組比較，*P＜0.05;與Ⅲ組比較，△P＜0.05。

Ⅰ組＊△

2.2 各組肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)比較 Ⅰ組肺泡上皮細(xì)胞未見陽性表達(dá);Ⅱ組肺泡上皮細(xì)胞呈淡黃色顆粒狀;Ⅲ組肺泡上皮細(xì)胞見棕褐色顆粒，呈強(qiáng)陽性表達(dá);Ⅳ組陽性產(chǎn)物表達(dá)明顯減輕。見插頁Ⅲ圖7。

2.3 各組ICAM-1基因在肺組織中相對(duì)表達(dá)量比較 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ICAM-1基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.75±0.18、4.0±0.56、13.6±1.56和6.99± 1.59。Ⅰ組ICAM-1表達(dá)不明顯，在Ⅱ、Ⅲ組呈上升趨勢(shì)，Ⅳ組表達(dá)下調(diào)，其余3組與I組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);Ⅳ組與Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

目前認(rèn)為，缺血再灌注導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制之一為依賴中性粒細(xì)胞的途徑［7］。ICAM-1介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附，是白細(xì)胞聚集、活化和釋放炎性介質(zhì)的關(guān)鍵［8］。在組織缺血再灌注情況下，大量的過氧化物和超氧自由基產(chǎn)生，而自由基和NO是缺血再灌注損傷中的重要因素［9］，二者可激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB具有與某些基因啟動(dòng)子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能，涉及各種信號(hào)機(jī)制的激活以及相應(yīng)的細(xì)胞效應(yīng)的產(chǎn)生［10］。造成包括ICAM-1在內(nèi)的炎性介質(zhì)的大量表達(dá)，使中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，且穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)周圍組織，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。中性粒細(xì)胞中存在MPO，每個(gè)細(xì)胞中所含的酶的量是一定的，MPO是中性粒細(xì)胞標(biāo)志性的酶，因此，組織中MPO可反映中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度［11］。

本研究中，在缺血組及缺血再灌注組，肺組織MPO量及ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，說明缺血再灌注肺損傷時(shí)，中性粒細(xì)胞及炎性因子作用存在。iNOS是催化合成一氧化氮的酶，左旋精氨酸在iNOS的催化下合成NO，它與活性氧自由基反應(yīng)生成具有細(xì)胞毒性的超氧亞硝酸離子(ONOOˉ)，對(duì)組織器官造成損害。AG是iNOS的抑制劑，可使iNOS活性降低，進(jìn)而減少NO等氧自由基的產(chǎn)生［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，AG治療組不但血清中NO量下降，而且ICAM-1的表達(dá)及相對(duì)表達(dá)量均下降，因此可以推斷，骨骼肌缺血再灌注肺損傷時(shí)AG可能通過減少氧自由基的產(chǎn)生，部分地阻止了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，打斷了炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使ICAM-1的表達(dá)下降，從而減輕了肺臟的缺血再灌注損傷。

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