曲巍，于波

(1沈陽市第四人民醫(yī)院，沈陽110016;2中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

心肌纖維化(MF)是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是高血壓左心室重構的主要表現(xiàn)［1］。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAS系統(tǒng))激活、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平增高是導致MF的主要原因［2］。2012年9月～2013年9月，本研究觀察新型醛固酮抑制劑依普利酮對自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠MF的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SHR大鼠28只，SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。隨機分為4組，即依普利酮組、替米沙坦組、聯(lián)合組及對照組，每組7只。分別采用灌胃給予依普利酮100 mg/(kg·d)、替米沙坦10 mg/(kg· d)、替米沙坦10 mg/(kg·d)+依普利酮100 mg/ (kg·d)、生理鹽水1 mL/d。用藥共8周。

1.2 主要試劑和儀器 依普利酮、替米沙坦等原料藥購自武漢富馳生物科技有限公司。兔抗大鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)抗體購自北京博奧森公司，兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子信號蛋白2(Smad2)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 尾動脈收縮壓測量 給藥前、給藥2周及7周應用尾套法測定尾動脈收縮壓［3］。連續(xù)測3次，取平均值。

1.3.2 左心室質(zhì)量指數(shù)、截面直徑測量 給藥8周，所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛2 mL/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定四肢，沿腹正中切開皮膚，暴露腹主動脈，以分叉處向心端1～3 mm處為穿刺點，采血8～10 mL，處死大鼠。取大體心臟標本，測量左心室質(zhì)量指數(shù)［3］。測量完心臟質(zhì)量后，迅速將心臟置于4%多聚甲醛中固定心肌組織，固定1周后，于長軸中點垂直橫切心臟，直接法測量左心室截面直徑，即分別測定最短徑(DAMIN)和最長徑(DMAN)，取其幾何平均值。

1.3.3 心肌組織HE染色 心室標本以4%甲醛緩沖液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟后石蠟包埋，制成石蠟標本。石蠟標本切片后進行脫蠟，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.3.4 心肌組織BMP-7、Smad2蛋白檢測 采用免疫組織化學方法，BMP-7和Smad2蛋白為定位于胞質(zhì)中的棕黃色顆粒，統(tǒng)計陽性細胞百分比［4］。

1.3.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以s表示，組間比較采用方差分析;計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組尾動脈收縮壓比較 見表1。

表1 各組尾動脈收縮壓比較(mmHg，s)

表1 各組尾動脈收縮壓比較(mmHg，s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別 n 給藥前 給藥2周 給藥7周依普利酮組 7 176.00±9.23 168.00±12.02 157.00±16.21*替米沙坦組 7 172.00±13.25 169.00±11.63 158.00±11.45*聯(lián)合組 7 174.00±9.76 170.00±13.71 172.00±23.27*對照組7 174.00±12.15 178.00±21.04 191.00±16.57

2.2 各組左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室截面直徑比較見表2。

表2 各組左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室截面直徑比較(s)

表2 各組左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室截面直徑比較(s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與聯(lián)合組比較，△P＜0.05。

組別 n左心室質(zhì)量指數(shù)(×10－3)左心室截面直徑(mm)依普利酮組 7 2.24±0.21＊△10.28±0.54替米沙坦組7 2.79±0.12 11.48±0.35聯(lián)合組 7 2.37±0.15* 10.69±0.43對照組7 2.81±0.33 12.23±0.61

2.3 各組HE染色結果 HE染色光鏡下可見SHR大鼠心肌細胞為長桿狀，結構單一，細胞質(zhì)含量多，細胞核染色深;心肌細胞間有少量纖維組織。依普利酮組及聯(lián)合組SHR大鼠心肌細胞排列整齊、連接緊密，胞膜完整，無明顯炎性細胞浸潤;對照組及替米沙坦組SHR大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌細胞肥大，細胞間質(zhì)纖維化，炎性細胞浸潤。

2.4 心肌組織BMP-7和Smad2免疫組化結果 見表3。

表3 各組心肌組織BMP-7和Smad2陽性染色細胞比較(%)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，MF過程有被阻止或逆轉(zhuǎn)的可能［5，6］，心室間充質(zhì)細胞作為心室瓣膜及室間隔最初存在的形式，都來自于上皮細胞衍生［7］。BMP-7是TGF-β1家族成員之一，能夠?qū)筎GF-β1作用。TGF-β1信號會被跨膜絲氨酸，蘇氨酸激酶Ⅰ型受體、Ⅱ型受體和細胞內(nèi)介質(zhì)Smad轉(zhuǎn)導［5］。Smad2、Smad3蛋白通過絲氨酸殘基磷酸化，與Smad4蛋白結合轉(zhuǎn)運到細胞核，在核內(nèi)控制TGF-β1反應基因轉(zhuǎn)錄。TGF-β1與BMP具有非常相似的信號轉(zhuǎn)導機制，同樣可以經(jīng)過激活細胞膜表面相應Ⅰ型、Ⅱ型受體，形成復合體，從而激活細胞內(nèi)Smad蛋白，轉(zhuǎn)入核內(nèi)，啟動相關的基因表達［6］。因此，BMP-7可能逆轉(zhuǎn)MF［7］，同時也可抑制心肌肥厚過程［8］。BMP激活Ⅱ型受體后，Ⅱ型受體可轉(zhuǎn)磷酸化Ⅰ型受體，進而激活下游Smads蛋白［9］。BMP家族通過Smad1對心肌細胞發(fā)揮保護作用，并且在心肌細胞分化、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。BMP2可通過Smad1進一步激活3-磷酸激酶，從而增強心肌收縮力［10］。BMP/ Smads參與心肌細胞的多種信號轉(zhuǎn)導，不同亞型在MF和凋亡的信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮不同的作用［11，12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，依普利酮組、替米沙坦及聯(lián)合組SHR大鼠心室的相對質(zhì)量明顯低于對照組，提示依普利酮、替米沙坦及二者聯(lián)合應用均可減緩SHR大鼠心室重構，抑制MF。本研究中依普利酮組心肌組織Smad2陽性表達低于對照組，依普利酮組及聯(lián)合組BMP-7陽性表達高于對照組。由此推測，依普利酮抑制SHR大鼠MF，促進BMP-7表達、抑制Smad2表達可能是其作用機制之一。

［1］孫少俐，陶志剛，王洪敏，等.高血壓病患者纈沙坦治療前后血清PCⅢ濃度的變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(7):13-15.

［2］Brilla CG.The fibrosis of right heart［J］.Cardiovase Res，2000，47(9):102-107.

［3］Jeffrey A，Towbin MD.Scarring in the Heart-ARevresible-Phenomenon［J］.N Engl J Med，2007，357(17):1767-1768.

［4］Wang，HX，Kolesnikova TV，Denison C，et al.The C-terminal tail of tetraspanin protein CD9contributes to its function and molecular organization［J］.J Cell Sci，2011，12(4):2702-2710.

［5］Zeisberg EM，Tarnavaski O，Zeisberg M，et al.Endothelial-tomesenchymal transition contribute to cardiac fibrosis［J］.Nat Med，2007，13(6):952-961.

［6］艾文，謝培益，陳延偉，等.阿托伐他汀對1型糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的作用及機制探討［J］.山東醫(yī)藥，2013，53 (24):32-35.

［7］王小君，楊方，孫娜，等.AcSDKP對大鼠心臟成纖維細胞MMP-1、TIMP-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50 (27):30-31.

［8］Iwano M，Plieth D，Danoff TM，et al.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue［J］.J Clin Invest，2002，110 (9):341-350.

［9］周劍鋒，袁發(fā)煥.BMP-7/BMP-7R/Smads，TGF-B與腎纖維化［J］.重慶醫(yī)學，2006，35(18):1709-1711.

［10］羅后廟，于永綱.BMP-7在心肌纖維化中作用的研究進展［J］.中國誤診學雜志，2008，8(5):3542-2543.

［11］Grimmer MR，Weiss WA.BMPs opposeMath1 in cerebellar development and in medulloblastoma［J］.Genes Dev，2008，22(7): 693-699.

［12］蔡輝，蔡佳玉，張靜，等.丹參酮ⅡA對壓力負荷增加大鼠心肌纖維化的影響及機制［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(10):14-16.