李永進 湯玉喜 唐潔 吳敏 楊艷

(湖南省林業(yè)科學院，長沙，410004)

轉基因庫安托楊對根際土壤微生物及酶活性的影響1)

李永進 湯玉喜 唐潔 吳敏 楊艷

(湖南省林業(yè)科學院，長沙，410004)

對4年生轉基因庫安托楊在生長過程中的土壤微生物和酶活性變化情況進行調查，發(fā)現(xiàn)轉基因與非轉基因株系的3大類根際微生物數(shù)量和蛋白酶活性分別表現(xiàn)為“增→減→增→減”和“減→增→減”的倒“S”型變化趨勢，土壤脲酶、磷酸酶酶活性的變化趨勢均呈“增→減”的倒“V”字型的變化趨勢，且轉基因庫安托楊基本未對微生物數(shù)量和酶活性產生顯著影響。

轉基因庫安托楊；根際土壤；土壤微生物；土壤酶活性

From the changes of soil microorganisms and enzyme activity caused by the growth of four-year transgenicPopulus×euramericana‘Guariento’, the number of microorganisms and proteinase activities showed “M” slope and lain letter S slope, respectively. But the change trend of soil urease and phosphotase activities showed lain letter V slope, and transgenicPopulus×euramericana‘Guariento’ had no significant effect on the number of microorganisms and proteinase activities (P>0.05).

20世紀90年代以來，轉基因生物的安全性受到學術界和整個社會的高度重視，轉基因植物對非目標生物和生態(tài)系統(tǒng)的影響成為一個研究熱點[1-5]。轉基因植物外源基因通過根系的分泌物、植物殘體和根系脫落物進入土壤中，一旦影響到土壤微生物的組成、區(qū)系和酶活性，就有可能影響整個土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能和農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的健康穩(wěn)定，因此轉基因植物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響進行研究是生態(tài)系統(tǒng)安全評價的重要方面。

楊樹是世界上中緯度地區(qū)廣泛栽培的重要用材樹種，同時也是林木基因工程領域的模式樹種。以往楊樹轉基因多是利用單個目的基因改良林木的個別性狀,利用轉基因技術將多種基因轉入楊樹改良其復雜性狀相對較少[6-9]。2006年王建革等[10]利用基因槍法同時將5個外源基因成功轉入庫安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’)并將成活植株進行田間耐澇生理試驗[11-12]。但轉基因庫安托楊是否會對土壤生態(tài)系統(tǒng)產生影響研究較少，有關洞庭湖區(qū)的轉基因庫安托楊對根際土壤微生物及酶活性的研究更未見報道。因此，我們對洞庭湖區(qū)轉基因庫安托楊對根際土壤微生物、酶活性進行了研究，以期為轉基因楊樹的推廣應用提供參考，并為進一步深入研究奠定基礎。

1 試驗地概況

試驗地位于岳陽市君山區(qū)(28°59′～29°38′N，112°43′～113°15′E)，屬中亞熱帶向北亞熱帶過渡氣候區(qū)，具有濕潤的大陸亞熱帶季風氣候，年平均氣溫17 ℃,極端高溫39.3 ℃,極端低溫-11.8 ℃,年平均降水量1 237.9 mm,年均相對濕度80%。土壤為湖潮土，土質肥沃，透水性較高。

2 材料與方法

2.1 供試材料

2009年以中國林業(yè)科學院提供的22個轉基因庫安托楊系號為材料，在岳陽市君山區(qū)上反嘴村進行環(huán)境釋放試驗，試驗林面積約0.25 hm2，造林密度為3 m×4 m。本研究選取轉基因庫安托楊其中的4個株系(D5-4、D5-9、D5-21、D5-25)及一個非轉基因對照株系(D5-0)，這4個株系含有不同數(shù)量的外源基因，其目的基因數(shù)量和種類已經過測定。轉基因庫安托楊所轉化的5個外源基因包括透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)、果聚糖蔗糖轉移酶基因(SacB)、BtCry3A基因、OC-1基因、JERF36基因。

2.2 土樣采集

于2012年5—11月的中旬用抖根法采集試驗林地內4個轉基因株系和1個非轉基因株系0～50 cm的根際土壤，取樣采取隨機取樣法，每個株系每次重復4次，將土樣裝入滅菌布袋中混合均勻。土樣采集后放入冰箱中4 ℃保存。

2.3 測定指標與方法

土壤全氮測定采用凱氏定氮法、全磷測定采用氫氧化鈉堿熔—鉬銻抗比法、全鉀測定采用氫氧化鈉堿熔—火焰光度法、有機質測定采用重絡酸鉀—外加熱法(GB7854—87)、土壤pH值采用pH計測定[13]。土壤微生物測定采用稀釋平板法：細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌用馬丁氏培養(yǎng)基,放線菌用改良高氏I號培養(yǎng)。土壤脲酶活性采用次氯酸鈉比色法測定、土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，土壤蛋白酶采用茚三酮比色法測定[14]。脲酶活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的質量表示；磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，以24 h后1 g土壤中酚的質量表示；蛋白酶活性以24 h后1 g土壤中氨基氮的質量表示。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS10.0、Excel等軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

3 結果與分析

3.1 試驗林土壤理化性質

在試驗林內隨機選取8個樣點采集0～50 cm土樣，然后進行理化性質的測定(表1)。發(fā)現(xiàn)8個土樣的理化性質的標準偏差值較小，證明試驗林土壤本底基本一致。

表1 試驗林土壤中各物質質量分數(shù)比較

3.2 轉多基因庫安托楊試驗林中微生物數(shù)量的變化

土壤中的微生物以細菌為主，占總數(shù)的90%以上，真菌最少(表2)。在同一月份，4個轉基因庫安托楊株系0～50 cm根際土壤中僅D5-25株系的細菌、放線菌和真菌的數(shù)量略高于對照，其他轉基因株系與非轉基因株系細菌、放線菌和真菌的數(shù)量基本相同；轉基因株系間、轉基因株系與對照間根際土壤中的細菌、放線菌和真菌數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)，這與周曉罡，趙蓬暉等[15-17]的研究結果相一致。在5—11月份的調查期內，轉基因與非轉基因株系的細菌、放線菌和真菌數(shù)量大致均呈“增→減→增→減”的變化趨勢，其中5月初由于土壤溫度和水分含量低，微生物處于相對封閉的環(huán)境，養(yǎng)分無法通過水分擴散，導致0～50 cm根際土層內3大類微生物的平均數(shù)量都低[18-20]；6—9月份是降雨高峰期，也是高溫期，土壤水分充足，利于養(yǎng)分的溶解，易于微生物吸收而使微生物快速繁殖；而10月份地表枯落物增加，可為微生物提供較多養(yǎng)分和能量，使得微生物總數(shù)仍處于較高水平；11月份細菌、放線菌和真菌的數(shù)量均有下降的趨勢。總體上看，根際土壤中細菌、真菌、放線菌的數(shù)量整體呈現(xiàn)隨降雨、溫度、濕度變化增加而遞增的趨勢[21]，且與非轉基因庫安托楊相比，轉基因庫安托楊沒有對細菌、放線菌和真菌產生顯著影響。但由于試驗林土壤生態(tài)系統(tǒng)組成、結構、功能復雜，相關機理還有待于做深入的研究和探討。

3.3 轉基因庫安托楊對土壤酶活性的影響

同一月份轉基因株系與對照株系0～50 cm土壤脲酶、磷酸酶和蛋白酶活性差異不顯著(表3)。3種酶活性隨季節(jié)的變化表現(xiàn)基本一致。其中，土壤脲酶、磷酸酶活性在5月份為最低值，分別介于0.09～0.13和2.86～3.22 mg/(g·d)之間，此后隨著進入楊樹生長旺期，轉基因楊與對照楊土壤內的土壤脲酶活性均迅速上升且變化規(guī)律一致，均在9月份達到最高值，分別介于0.37～0.46和5.98～6.52 mg/(g·d)之間，之后隨著氣溫的降低開始下降，在整個調查期內，5個株系0～50 cm根際土壤中的脲酶、磷酸酶活性大致呈“增→減”的倒“V”字型變化趨勢；而蛋白酶活性6月份最低，變化范圍為1.6～1.8 mg/(kg·d)，而10月份蛋白酶活性最高，介于4.91～5.25 mg/(kg·d)，之后隨著氣候的降低蛋白酶活性逐漸下降。在5—11月份調查期間，轉基因庫安托楊與對照0～50 cm土壤蛋白酶活性均呈減→增→減的倒“S”型變化趨勢。5—11月的土壤脲酶(8月份除外)、磷酸酶、蛋白酶活性與對照均無顯著差異(P>0.05)。表明調查期內轉基因楊對土壤脲酶、磷酸酶、蛋白酶活性影響不明顯，但是長期種植轉基因庫安托楊是否會造成影響，還需要進一步研究。

表2 轉基因株系土壤根際微生物數(shù)量季節(jié)動態(tài)變化

月份放線菌/106個·g-1D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月18.16±1.7815.16±1.6614.15±0.5414.56±3.0514.57±0.296月18.16±3.0118.00±3.3719.75±1.9523.39±2.0922.26±2.517月18.16±4.1837.43±6.2223.95±5.1925.44±7.0133.32±4.868月18.16±3.5322.23±3.7122.03±1.1420.07±1.2119.88±1.099月18.16±3.2433.77±2.8736.45±3.7635.62±4.0139.97±2.7810月18.16±2.7320.98±4.3224.96±1.9926.14±2.2321.85±1.3111月18.16±2.1513.79±3.0912.34±2.1217.38±3.2217.98±1.76

月份細菌/107個·g-1D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月18.16±0.100.49±0.230.38±0.170.31±0.090.58±0.186月18.16±0.523.10±0.413.60±0.363.92±0.694.62±0.677月18.16±0.252.80±0.473.05±0.312.82±0.373.24±0.308月18.16±0.563.47±0.494.32±0.614.86±0.714.38±0.519月18.16±0.672.27±0.713.07±0.574.25±0.922.63±0.6610月18.16±0.301.93±0.212.55±0.282.75±0.422.69±0.4111月18.16±0.100.37±0.140.19±0.890.11±0.160.37±0.18

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

4 結論與討論

一直以來，轉基因植物對土壤生態(tài)系統(tǒng)可能造成的影響一直是人們進行轉基因植物安全性評價的焦點。研究者們在轉基因林木對土壤微生物數(shù)量、酶活性的影響方面存在不同意見[22-26]。有些學者認為由于植物殘體及根際分泌物帶給土壤的Bt毒蛋白需要一定的時間才能消解，可能對土壤微生物區(qū)系、酶活性產生影響，使根際土壤的磷酸酶活性、脫氫酶和堿性磷酸酶活性顯著降低[27]。但大部分研究結果尚未發(fā)現(xiàn)轉基因植物對土壤微生物、酶活性產生明顯影響。如對轉基因的棉花、轉雙價抗真菌基因水稻、轉幾丁質酶基因水稻等從生長繁殖到衰老過程中根際部位土壤中的土壤脲酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、脫氫酶、多酚氧化酶和蛋白酶等酶的活性與對照相比均無顯著差異；轉基因小黑楊根際分泌物不會對土壤多酚氧化酶、脲酶及磷酸酶活性產生顯著性影響等[28-29]。

本文將試驗林內轉基因植株與非轉基因根際土壤中的細菌、放線菌和真菌3類微生物進行了比較，初步證明庫安托楊轉基因植株根際土壤3類微生物數(shù)量與非轉基因植株之間雖在不同時期存在一定差異，但未達到統(tǒng)計學顯著水平。這與胡建軍等先后對轉基因歐洲黑楊、轉基因銀腺楊(P.alba×P.glandulosa)和轉抗蟲基因(BtCry3A)741楊試驗林土壤微生物進行研究發(fā)現(xiàn)其根際土壤微生物區(qū)系未發(fā)生明顯的變化相一致[30-31]。

表3 轉基因株系土壤酶活性季節(jié)動態(tài)變化 mg·g-1·d-1

月份磷酸酶D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月3.22±0.143.20±0.043.11±0.112.86±0.112.93±0.116月3.71±0.124.00±0.174.03±0.093.78±0.173.93±0.197月4.28±0.184.60±0.214.21±0.244.12±0.224.36±0.228月4.54±0.194.71±0.354.45±0.314.94±0.314.91±0.329月5.98±0.196.42±0.496.29±0.396.16±0.286.52±0.2710月4.60±0.384.19±0.274.11±0.423.51±0.464.51±0.3311月2.89±0.423.61±0.184.02±0.393.03±0.533.17±0.38

月份蛋白酶D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月2.09±0.121.92±0.221.81±0.191.90±0.202.14±0.116月1.65±0.071.8±0.161.60±0.091.75±0.121.76±0.107月1.97±0.071.93±0.031.80±0.051.84±0.091.99±0.098月1.83±0.152.14±0.052.21±0.182.06±0.162.24±0.229月3.71±0.193.14±0.253.30±0.093.35±0.173.40±0.3110月4.91±0.135.01±0.095.25±0.114.93±0.235.11±0.2311月4.05±0.194.28±0.174.54±0.214.44±0.404.58±0.31

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；8月份土壤脲酶與對照比差異顯著(P<0.05)。

土壤酶在土壤有機物分解和營養(yǎng)元素循環(huán)過程中起到不可或缺的作用，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)中的能量轉化、土壤微生態(tài)的環(huán)境質量和作物產量。本文研究結果表明，轉基因庫安托楊試驗林土壤脲酶、磷酸酶和蛋白酶活性與非轉基因庫安托楊之間同一月份不存在顯著性差異，且3種土壤酶活性存在明顯的季節(jié)性變化。但引起土壤微生態(tài)的波動的因素較多，此僅為1 a的調查數(shù)據(jù)，因此，需要繼續(xù)進行長時間的跟蹤調查研究，獲得較全面的轉基因樹木安全性的基礎數(shù)據(jù)，以評估其大面積釋放的安全性。

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Effect of TransgenicPopulus×euramericana‘Guariento’ on the Microorganism and the Enzyme Activity in the Rhizosphere Soil

Li Yongjin, Tang Yuxi, Tang Jie, Wu Min, Yang Yan(Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(2)：55-58.

TransgenicPopulus×euramericana‘Guariento’; Rhizosphere soil; Soil microorganisms; Soil enzyme activity

1) 湖南省自然科學基金項目(12JJ3031)；國家林業(yè)局科技發(fā)展中心項目(JJ-11-01)。

李永進，男，1980年 9 月生，湖南省林業(yè)科學院，助理研究員。 E-mail：youngon@126.com。

2014年9月23日。

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責任編輯：潘 華。