西娜 劉超

儲(chǔ)存條件對(duì)全血樣本他克莫司血藥濃度監(jiān)測(cè)的影響

西娜 劉超

目的 考察兩種儲(chǔ)存條件對(duì)全血樣本他克莫司血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果的影響。方法 采集臨床腎移植術(shù)后患者口服他克莫司后12 h靜脈全血樣本20份，分別在室溫(25℃)和冰箱冷藏(4℃)避光儲(chǔ)存，用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測(cè)定0、24、72 h時(shí)他克莫司的血藥濃度。結(jié)果 全血樣本在兩種儲(chǔ)存條件下72 h內(nèi)，他克莫司的血藥濃度無(wú)顯著性變化(P＜0.05)，RSD＜5%。結(jié)論 他克莫司全血標(biāo)本在室溫(25℃)和冰箱冷藏(4℃)避光儲(chǔ)存72 h內(nèi)保持穩(wěn)定，不影響測(cè)定結(jié)果，故因特殊情況不能及時(shí)送檢的樣品在上述兩種儲(chǔ)存條件下72 h內(nèi)仍有檢測(cè)價(jià)值。

他克莫司;血藥濃度監(jiān)測(cè);儲(chǔ)存條件;全血

他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)系從放射花線菌的發(fā)酵液中提取的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是第二代免疫抑制藥的代表性藥物，廣泛用于器官移植的抗排斥反應(yīng)，如肝移植、腎移植、肺移植、角膜移植等，具有藥效強(qiáng)、使用劑量低、器官存活率高、急性排斥反應(yīng)發(fā)生率低等特點(diǎn)［1］。研究證實(shí)，F(xiàn)K506在體內(nèi)和體外抑制淋巴細(xì)胞活性的能力比環(huán)孢素強(qiáng)10～100倍，且應(yīng)用其防止排斥反應(yīng)的有效劑量不到環(huán)孢素的1/100～1/10［2］。但它口服吸收生物利用度及藥物動(dòng)力學(xué)個(gè)體差異較大，導(dǎo)致個(gè)體濃度波動(dòng)較大［3］。FK506濃度過(guò)高時(shí)易導(dǎo)致毒性產(chǎn)生如神經(jīng)毒性、腎毒性和高血糖發(fā)生［4］，過(guò)低時(shí)易并發(fā)急性排斥反應(yīng)［5］。因此需對(duì)其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)(therapeutic drug monitoring，TDM)，以使免疫抑制藥的安全性和療效達(dá)到最優(yōu)化［6］，減少醫(yī)生僅憑借臨床經(jīng)驗(yàn)及患者用藥反應(yīng)來(lái)調(diào)整給藥劑量帶來(lái)的盲目性［7］。來(lái)中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院進(jìn)行移植術(shù)后FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)的外地患者占很大比例，因血液成分復(fù)雜，故未離心處理的全血樣本在放置一段時(shí)間后，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性是否受到影響是一個(gè)必須要面對(duì)的問(wèn)題。許多患者紛紛咨詢血樣是否必須在取血當(dāng)天測(cè)定，其保存溫度有何特殊要求等等，為給患者一個(gè)科學(xué)、滿意的答復(fù)，我們對(duì)他克莫司全血樣本保存的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 ARCHITECT i1000型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)Abbott公司);XSYSTEMS 9527-26離心機(jī)(SIGMA公司);Mixmate渦旋混勻儀(EPPENDORF公司);BE-2011振蕩器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造廠);美菱BCD-205L3C冰箱(合肥美菱股份有限公司);EN05239微量加樣器100 μl(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 試劑 ARCHITECT 1L77他克莫司專用試劑盒(美國(guó) Abbott公司，批號(hào) 29268M500);ARCHITECT 1L77他克莫司專用試劑盒定標(biāo)液(美國(guó)Abbott公司，批號(hào)29268M500);ARCHITECT 1L77-55他克莫司全血沉淀劑20.4 ml(美國(guó)Abbott公司，批號(hào)308518);1P05-10雅培免疫抑制劑-復(fù)合質(zhì)控品2 ml(美國(guó)Abbott公司，批號(hào)47k14313)。

1.3 方法

1.3.1 儀器檢查校正:按照ARCHITECT i1000操作手冊(cè)開(kāi)機(jī)自檢。

1.3.2 FK506全血藥物濃度的測(cè)定及質(zhì)量控制。

1.3.2.1 樣本采集:FK506全血藥物谷濃度的樣本采集應(yīng)于患者末次服用FK506后12 h進(jìn)行［8］，血液樣本取自腎移植術(shù)后患者外周靜脈，樣本采集量不少于2 ml，置于EDTA-K2抗凝管中。

1.3.2.2 樣本測(cè)定:全血樣本搖勻后，精密吸取血樣200 μl置于離心管中，加入蛋白沉淀劑 200 μl，于渦旋振蕩器上振蕩10 s，再用高速離心機(jī)以13 000 r/min(離心半徑8 cm)離心4 min，取上清液至樣品管，再渦旋振蕩10 s，放入ARCHITECT i1000中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2.3 儀器定標(biāo)與精密度試驗(yàn):試驗(yàn)前對(duì)ARCHITECT i1000全自動(dòng)免疫分析儀的FK506試劑盒定標(biāo)，定標(biāo)濃度分別為 0、3、6、12、20、30 ng/ml，儀器通過(guò)定標(biāo)并自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。連續(xù)5 d對(duì)隨行質(zhì)控進(jìn)行測(cè)定，質(zhì)控品分為低(4.64 ng/ml)、中(8.81 ng/ml)、高(16.80 ng/ml)3個(gè)濃度。

1.3.2.3.1 日內(nèi)精密度:分別吸取3個(gè)濃度的全血質(zhì)控樣本，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)濃度的質(zhì)控樣本經(jīng)處理后各進(jìn)樣5次，記錄數(shù)值，求出平均值、SD及RSD，計(jì)算日內(nèi)精密度。

1.3.2.3.2 日間精密度:分別吸取3個(gè)濃度的全血質(zhì)控樣本，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)濃度的質(zhì)控樣本經(jīng)處理后于5 d內(nèi)分5次進(jìn)樣，記錄數(shù)值，求出平均值、SD及RSD，計(jì)算日間精密度。

1.3.2.4 實(shí)驗(yàn)分組與血樣儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究:隨機(jī)抽取40份來(lái)我院需監(jiān)測(cè)FK506濃度的腎移植術(shù)后患者的全血樣本，其中男23份，女17份;年齡24～65歲。隨機(jī)均分為2組，每組20份樣本。取血當(dāng)天測(cè)全血藥物濃度，再將1～20號(hào)樣本常溫(25℃)避光放置24 h、72 h，21～40號(hào)樣本于冰箱冷藏室(4℃)避光放置24 h、72 h，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定每個(gè)樣本放置24 h與72 h后的FK506濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，將1～40號(hào)樣本24、72 h的測(cè)定結(jié)果與0 h的測(cè)定結(jié)果分別進(jìn)行雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 儀器定標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=4.8×10512727x，相關(guān)系數(shù)r=0.9980，相關(guān)性佳。

2.2 精密度試驗(yàn) 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，全血中他克莫司3個(gè)濃度的質(zhì)控樣本測(cè)定結(jié)果如下表，RSD均＜5%，符合2010年版《中國(guó)藥典》對(duì)生物樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)＜15%的要求。見(jiàn)表1、2。

2.3 血樣儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究 常溫組(1～20號(hào)樣本)與冷藏組(21～40號(hào)樣本)在儲(chǔ)存24、72 h后他克莫司血藥濃度的RSD均＜15%，有臨床參考意義。常溫組與冷藏組共40個(gè)樣本在同一條件儲(chǔ)存不同時(shí)間，其測(cè)定結(jié)果差異均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，顯示樣品穩(wěn)定，對(duì)臨床因特殊情況不能及時(shí)送檢的樣品在上述兩種儲(chǔ)存條件下72 h內(nèi)仍有檢測(cè)價(jià)值。見(jiàn)表3、4。

表1 全血中他克莫司濃度測(cè)定日內(nèi)精密度考察結(jié)果

表2 全血中他克莫司濃度測(cè)定日間精密度考察結(jié)果

表3 他克莫司全血樣本25℃、4℃條件下儲(chǔ)存的濃度變化

3 討論

目前FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)方法有微粒子酶免疫法(MEIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、酶放大免疫法(EMIT)、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(CMIA)和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)等。CMIA法是用于FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)的最新方法。它是將化學(xué)發(fā)光原理與競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定相結(jié)合形成的分析技術(shù)，同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫測(cè)定的特異性，分析不受樣品中高濃度的血紅蛋白、脂類、膽紅素的影響，與其他方法的相關(guān)性好，適合臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)使用［9］，具有特異性好、敏感性高、可定量、全自動(dòng)操作、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［10］。作為全軍移植中心，我院移植患者數(shù)量較多，CMIA法的檢測(cè)范圍較大，比較適合我院使用。

表4 他克莫司全血樣本25℃、4℃保存時(shí)血藥濃度穩(wěn)定性的t檢驗(yàn)結(jié)果 n=20

檢測(cè)他克莫司血藥濃度時(shí)，通常采用全血來(lái)做為檢測(cè)標(biāo)本，這是因?yàn)?(1)全血/血漿中他克莫司濃度的分布為20∶1，全血中藥物濃度較高，更易達(dá)到檢測(cè)靈敏度要求;(2)血漿濃度穩(wěn)定性高，但比全血濃度變異性大;(3)患者個(gè)體差異較大，血藥達(dá)峰時(shí)間并不一致，故他克莫司血藥濃度監(jiān)測(cè)為全血谷值濃度，采血時(shí)間便于掌握且波動(dòng)較小，所以臨床檢測(cè)一般不用血漿而以全血為主［11］。

在臨床治療藥物劑量調(diào)整時(shí)，醫(yī)生需要綜合考慮患者的病理狀態(tài)、生理生化指標(biāo)及體內(nèi)藥物濃度之間的相關(guān)性來(lái)做出準(zhǔn)確的判斷，而治療藥物監(jiān)測(cè)所提供的血藥濃度的準(zhǔn)確性是做出這種正確判斷的基礎(chǔ)。因此，我們認(rèn)為需要建立良好的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、可行的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)，避免或減少由于測(cè)定本身帶來(lái)的誤差。故實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了儀器定標(biāo)與精密度試驗(yàn)，結(jié)果顯示低、中、高3個(gè)濃度的RSD均小于5%，符合2010年版《中國(guó)藥典》對(duì)生物樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于15%的要求，亦確保本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

經(jīng)筆者檢索相關(guān)文獻(xiàn)，口服他克莫司患者的全血標(biāo)本在不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性考察尚未見(jiàn)報(bào)道。通常我們收到樣本后會(huì)盡快檢測(cè)，以免影響濃度測(cè)定結(jié)果。而本研究結(jié)果表明，全血標(biāo)本在室溫(25℃)和冰箱冷藏(4℃)儲(chǔ)存72 h內(nèi)，所測(cè)定的他克莫司血藥濃度結(jié)果無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，為臨床儲(chǔ)存他克莫司全血標(biāo)本的條件提供了實(shí)驗(yàn)參考依據(jù);并提示日常監(jiān)測(cè)時(shí)我們可在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下靈活掌握測(cè)定時(shí)間，外地患者也可根據(jù)實(shí)際情況靈活選擇送血樣的時(shí)間和方式，不必急于當(dāng)天將樣品送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于其他季節(jié)的不同室溫以及更長(zhǎng)時(shí)間對(duì)他克莫司血藥濃度測(cè)定的影響將會(huì)在今后的工作中進(jìn)一步考察。

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R 914.1

A

1002-7386(2015)18-2849-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．18．046

100091 北京市，中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院藥劑科(西娜);河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系(劉超)

2015-03-18)