梁宗英 侯繼申 董曉利 張召 張旭 辛國華

大蒜素干預(yù)下大鼠血清對食管癌EC109細胞凋亡及Survivin表達的影響

梁宗英 侯繼申 董曉利 張召 張旭 辛國華

目的 研究大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清誘導(dǎo)食管癌EC109細胞凋亡及其對Survivin蛋白表達的影響。方法 Ⅰ組:以普通滅活SD大鼠血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細胞;Ⅱ組:以大蒜素干預(yù)SD大鼠滅活血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細胞;采用AnnexinⅤ-EGFP/PI雙染法和亞倍體峰法應(yīng)用流式細胞儀檢測2組食管癌細胞早期和中晚期凋亡率;Survivin蛋白的表達應(yīng)用Western blot方法檢測。結(jié)果 Ⅱ組細胞凋亡率明顯高于Ⅰ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜＜0.05);Ⅱ組細胞中Survivin蛋白的表達水平明顯低于Ⅰ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 長期大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清能促進食管癌EC109細胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表達。

大蒜素;大鼠;食管癌;EC109細胞;細胞凋亡;Survivin蛋白

大蒜素的主要成分為二烯丙基三硫化物，是從食用大蒜中提取出的一種具有多種生物活性的混合物［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在大蒜素具有的多種生物學(xué)活性中，除抗菌殺毒、降血脂以及增加機體免疫力等常規(guī)功能外，抗腫瘤的作用最為重要［2］。近幾年有學(xué)者對大蒜素抗癌作用的分子機制進行了廣泛深入的研究探討，但大蒜素對食管癌細胞的凋亡以及Survivin蛋白表達是否有影響研究較少。為了進一步研究探討大蒜素的抗癌機制，本實驗進行了應(yīng)用長期大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清誘導(dǎo)食管癌EC109細胞凋亡及其對Survivin蛋白表達的影響研究，為其在食管癌防治中的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠購于天津醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。食管癌EC109細胞株來自西安交通大學(xué)研究生教學(xué)實驗中心。大蒜素購于徐州萊恩藥業(yè)有限公司(規(guī)格:2.5 g/瓶;劑型:粉末)。AnnexinⅤ-EGFP ＜ 試劑盒購于沈陽萬類生物科技發(fā)展有限公司。小鼠抗人Survivin單克隆抗體購于天津金橋生物技術(shù)有限公司。β-Actin一抗和山羊抗小鼠二抗購于美國 Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 血清制備:40只大鼠，正常飼養(yǎng)，無特殊處理。每日給予大蒜素15 mg·kg-1·d-1，肌內(nèi)注射。24周后，取大鼠內(nèi)眥靜脈血，溫浴離心后，分離血清。高溫水浴滅活血清，過濾除菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗分組:Ⅰ組:以含20%普通SD大鼠滅活血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細胞;Ⅱ組:以含20%大蒜素干預(yù)SD大鼠滅活血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細胞。

1.2.3 細胞凋亡率的測定:應(yīng)用含有兩種血清的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集細胞。加入PBS離心，細胞計數(shù)后調(diào)成設(shè)定濃度。取細胞懸液，分別加入AnnexinⅤ-EGFP和PI進行染色后應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。同樣方法收集2組培養(yǎng)成功的細胞，加入乙醇后固定，4℃離心棄凈乙醇，加入磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液，室溫下間歇搖動，再次離心棄去上清，加入PI染色，室溫避光15 min后檢測細胞中晚期凋亡率。

1.2.4 Survivin蛋白的表達:取對數(shù)生長期細胞接種于培養(yǎng)瓶，應(yīng)用含有兩種不同血清的細胞培養(yǎng)液處理細胞后，提取細胞蛋白質(zhì)后，進行分離及濃度測定;蛋白穩(wěn)壓電泳后，以2 mA/cm2恒流轉(zhuǎn)膜;用含0.25%脫脂奶粉封閉液中，室溫搖動2 h;加一抗4℃孵育過夜;應(yīng)用TBST緩沖液洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，洗膜后應(yīng)用ECL發(fā)光法，顯像膠片采用薄層色譜掃描儀來測定印跡區(qū)帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 細胞的凋亡 Ⅱ組早期凋亡率明顯高于Ⅰ組，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而Ⅱ組中晚期細胞凋亡率較Ⅰ組仍明顯增高，統(tǒng)計學(xué)差異有意義(P＜0.05)。見表1，圖1～4。

表1 2組食管癌EC109細胞凋亡率比較%，±s

表1 2組食管癌EC109細胞凋亡率比較%，±s

注:與Ⅰ組比較，*P ＜0.05

組別 凋亡率早期凋亡率 中晚期凋亡率Ⅰ組2.98±0.93 0.91±0.22Ⅱ組 7.72±1.31* 12.42±1.43*

圖1 Ⅰ組EC109細胞早期細胞凋亡率(Annexin V-EGFP/PI法)

圖2 Ⅱ組EC109細胞早期細胞凋亡率(Annexin V-EGFP/PI法)

圖3 Ⅰ組EC109細胞中晚期細胞凋亡率(亞倍體峰法)

圖4 Ⅱ組EC109細胞中晚期細胞凋亡率(亞倍體峰法)

2.2 Survivin蛋白的表達 對曝光X線片掃描后，應(yīng)用凝膠圖像分析處理軟件處理后結(jié)果顯示，Ⅱ組 Survivin蛋白表達量明顯低于Ⅰ組。見圖5。

3 討論

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來全球食管癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢［3］。我國一直是食管癌的高發(fā)地區(qū)，食管癌發(fā)病率和死亡率均居世界之首［4］。目前食管癌的治療仍以手術(shù)、放化療為主要手段，盡管有一定療效，但常常對機體產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)［5］。因此，加強對食管癌藥物預(yù)防以及治療的深入研究，改善食管癌患者的生存質(zhì)量，延長患者的生存期是臨床工作者面臨的首要任務(wù)。近幾年有學(xué)者對大蒜素抗癌作用的分子機制進行了廣泛深入的研究探討，但大蒜素對食管癌細胞的增殖以及凋亡是否有影響研究較少。研究食管癌的病因、發(fā)展轉(zhuǎn)移機制及對藥物的反應(yīng)性，對食管癌的防治有重要意義［6］。

圖5 EC109細胞Survivin蛋白表達水平

細胞凋亡是多細胞生物最常見的一種基本生命活動，是機體維持正常生理活動所必需的，對機體正常功能的維持具有重要意義［7］。無限的細胞增殖并不是人體腫瘤發(fā)生的原因，人類某些腫瘤發(fā)生的最主要原因的通過抑制細胞凋亡途徑或凋亡功能的喪失導(dǎo)致的增殖與凋亡之間的失衡造成的。通過強化凋亡基因活性的表達、誘導(dǎo)細胞凋亡達到殺死或者加速腫瘤細胞的死亡是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)防癌、抗癌藥物發(fā)揮其功能的重要途徑。在諸多抑制和影響細胞凋亡的因素中，作用最強研究最多的是Survivin蛋白。Survivin蛋白是一種在人體正常分化組織中不表達而在腫瘤組織中普遍表達的，具有調(diào)節(jié)細胞分化和抑制細胞凋亡雙重功能的小分子量肽類［8］。Survivin通過下調(diào)腫瘤細胞 Survivin蛋白的表達量和抑制相關(guān)蛋白的功能而實現(xiàn)其強大的抗凋亡作用，從而達到治療腫瘤的目的［9，10］。目前Survivin抗凋亡作用的機制主要是依賴在細胞凋亡中起核心作用的caspase直接或間接抑制起始因子而抑制凋亡，或者是Survivin基因決定簇缺失或突變而誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自發(fā)性凋亡，從而抑制腫瘤的生長［11］。體外實驗證實，大蒜素的抗腫瘤機制涉及多個靶點，作用機制主要包括抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡壞死、抗腫瘤血管生成、影響腫瘤細胞信號傳遞等一系列的化學(xué)預(yù)防和治療途徑。大蒜素具有抗腫瘤活性不僅表現(xiàn)在其可通過多種途徑干擾腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，而且還具有直接殺傷腫瘤細胞的能力，為應(yīng)用大蒜素治療和預(yù)防癌癥提供了理論依據(jù)［12］。

本實驗結(jié)果表明:由實驗測得的調(diào)亡率結(jié)果分析顯示，經(jīng)過大蒜素干預(yù)的實驗鼠滅活血清培養(yǎng)的食管癌細胞凋亡率明顯高于普通血清培養(yǎng)的食管癌細胞，說明大蒜素干預(yù)的實驗鼠滅活血清可以促進食管癌EC109細胞的凋亡。而且經(jīng)過Western-Blot技術(shù)驗證，經(jīng)大蒜素干預(yù)的大鼠血清培養(yǎng)的食管癌EC109細胞Survivin蛋白的表達量較普通大鼠血清組明顯下降。說明大蒜素可以通過某些途徑抑制Survivin基因?qū)?yīng)表達的Survivin蛋白的功能而誘導(dǎo)細胞凋亡，從而達到抗腫瘤的目的。大蒜素作為一種純天然藥物，對腫瘤細胞作用的靶點和途徑是多方面的，與其他化療藥比較，具有對人毒性小、體內(nèi)無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢。隨著大蒜素抗癌作用研究日趨成熟和深入，大蒜素抑制腫瘤的增殖以及促進凋亡的具體機制還有待進一步深入的研究，這對更好發(fā)揮大蒜素抗腫瘤功效具有重要意義［13］。

長期大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清能促進食管癌EC109細胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表達。大蒜素經(jīng)過體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后可以通過某些途徑促進細胞凋亡，但促進凋亡的具體機制還有待進一步深入研究。

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The effect of rats serum treated by allicin on the apoptosis of esophagus cancer EC-109 cells and the expression levels of Survivin

LIANG Zongying* ，HOU Jishen* ，DONG Xiaoli，et al．*Department of Thoracic Surgery，Affiliated Hospital ofChengde Medical College，Hebei，Chengde 067000，China

Objective To investigate the effect of SD rats serum after intervention by allicin on the apoptosis of esophagus cancer EC-109 cells cell and the expression levels of Survivin.Methods The groupⅠ:esophagus cancer EC109 cells were cultured in normal inactivated SD rat serum medium;groupⅡ:esophagus cancer EC109 cells were cultured in inactivated SD rat serum medium plus allicin，then the cell apoptosis rates were detected by AnnexinⅤ-EGFP/PI double-standing and hypoploid peak method with flow cytometer，furthermore the expression levels of Survivin were measured by Western Blot.Results The cell apoptosis rates in groupⅡwere significantly higher than those in groupⅠgroup(P＜0.05)，however，the expression levels of Survivin protein in groupⅡ were significantly lower than those in groupⅠ(P ＜ ＜0.05).Conclusion The serum of SD rat after long-term intervention by allicin can promote the apoptosis of esophagus cancer EC109 cells and can inhibit the expression of Survivin protein.

allicin;rat;esophagus cancer;EC109 cell;cell apoptosis;Survivin protein

R 735.1

A

1002-7386(2015)23-3528-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．002

067000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科(梁宗英、侯繼申、張召、張旭、辛國華);河北省石家莊市優(yōu)撫醫(yī)院外一科(董曉利)

辛國華，061000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;E-mail:X215929@163.com

2015-07-20)