羊 悅，祝燕燕，楊勝利

（浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014）

蟲草素（Cordycepin）是Cunningham 等在1951 年從蛹蟲草的培養(yǎng)濾液中得到的第一個從真菌里分離出來的核苷類抗生素[1]，是冬蟲夏草的有效成分，也是蟲草中特有的成分[2]。蟲草素作為一個細胞毒性物質具有抗癌、抑制病毒、抑菌、抑制蛋白激酶等作用[3-8]，在治療白血病、降血脂血糖及十大惡性疾病的臨床治療上有著廣闊的應用前景。

目前，蟲草素的來源主要包括從天然或人工培養(yǎng)的子實體中提取，發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體及發(fā)酵液中提取以及化學法合成。受野生蟲草生存環(huán)境的特殊性、寄主專一性及濫采濫挖的影響，野生蟲草資源日益枯竭，因此從野生蟲草中提取蟲草素成本高昂且含量少，不足以滿足市場需求?；瘜W合成技術路線復雜且產生大量對環(huán)境有害的物質。隨著發(fā)酵技術的發(fā)展，通過菌種發(fā)酵產蟲草菌素的技術也日益成熟，主要可分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。相比于液體發(fā)酵固體發(fā)酵具有能耗低、設備技術簡易、廢水廢渣少等優(yōu)點。

啤酒糟（Brewer’s spent grain，BSG）俗稱為麥糟，是麥芽和大米、淀粉等輔料經過糊化、糖化、過濾糖化醪后分離得到的一種不溶性殘渣，是啤酒工業(yè)的主要副產物，是一種低成本的食品級廢棄物。其主要成分為麥芽殼，含豐富的粗蛋白和粗纖維，可以作為食用菌生長的培養(yǎng)基[9-11]。

迄今，國內外許多學者對蟲草菌的液體深層培養(yǎng)進行了大量的研究，但對于固體發(fā)酵蟲草菌的研究較少。本研究擬對利用啤酒糟為基質固體發(fā)酵產蟲草素的培養(yǎng)基條件進行探索及優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

尖頭北蟲草，購自梁山正大食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，葡萄糖40 g/L，瓊脂15 g/L，氯霉素0.1 g/L；種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，L-甘氨酸1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，氯霉素0.1 g/L；

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法：

斜面培養(yǎng)：挑取保藏的蟲草菌種菌絲體接種于斜面，22 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d，至菌絲體布滿斜面。

種子液培養(yǎng)：將活化后的斜面接種于種子培養(yǎng)基中，在22 ℃，170 r/min 的搖床條件下振蕩培養(yǎng)7 d，至培養(yǎng)基中有均勻分布的松散菌絲體。

固體發(fā)酵：將烘干至恒重的啤酒糟粉末與水混合均勻作為初始固體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min，冷卻待用。將培養(yǎng)好的種子液以10%（v/w）接種量接入固體培養(yǎng)基中，在22 ℃下進行恒溫發(fā)酵培養(yǎng)。

取樣:發(fā)酵完的固體培養(yǎng)物取出與真空干燥箱中烘干至恒重，經研磨后得待測樣品粉末。樣品中蟲草素的含量用HPLC 法檢測。

1.2.2 含水量的篩選

調整啤酒糟粉末與水的料水比（50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%），使培養(yǎng)基濕重為50 g。在無菌操作下每瓶接種5 mL 種子液。在暗處萌發(fā)菌絲至菌絲長滿后進行光照培養(yǎng)。以蟲草素的積累量為指標，選出最佳含水量。

1.2.3 碳源及其濃度的篩選

在確定最佳含水量的固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎上，對培養(yǎng)基的碳源進行優(yōu)化。實驗中分別以20 g/L 蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、甘露醇為唯一碳源加入營養(yǎng)液，在無菌操作下每瓶接種5 mL種子液。以蟲草素的積累量為指標，選出最適碳源，后在最適碳源基礎上對其濃度進行一系列優(yōu)化。

1.2.4 氮源及其濃度的篩選

在最適碳源及其濃度的基礎上分別以20 g/L的蛋白胨、豆粕、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨作為唯一氮源加入營養(yǎng)液，在無菌條件下每瓶接種量5 mL 以蟲草素的積累量為指標，選出最適氮源，后在最適氮源基礎上對其濃度進行優(yōu)化。

1.2.5 無機鹽的篩選

在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎上，設置6 種無機鹽作為6 個因素，進行6 因素2 水平的正交試驗，對比不同無機鹽對蟲草素在啤酒糟固體培養(yǎng)基上的積累的影響，實驗因素和水平見表1。

表1 無機鹽優(yōu)化正交實驗Table 1 orthogonal dsign for inorganic salts

1.3 試驗樣品中蟲草素含量的檢測

取發(fā)酵后的基質，經低溫干燥至恒重后粉碎，精密稱取0.5 g 加10 mL 蒸餾水，冰水浴超聲提取60 min，離心分離上清液后經雙層0.45 μm水系膜過濾，用HPLC 測定。

色譜條件：Ecilipse XDB-C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動相：甲醇：水=15：85；柱溫：30 ℃；紫外波長：259 nm；進樣量：10 μL。

2 結果與分析

2.1 不同含水量對蟲草素積累的影響

圖1 為不同含水量條件下固體培養(yǎng)基基質中蟲草素含量的柱狀圖，結果顯示，不同濃度的含水量對蟲草素含量的積累存在不同的作用。在含水量較低時，菌絲體生長速度較快（數(shù)據(jù)未體現(xiàn)），但菌絲體呈現(xiàn)較稀疏，不濃密的狀態(tài)且不利于代謝產物蟲草素的積累。隨著含水量濃度的增加，培養(yǎng)基中的蟲草菌絲體生長旺盛有活力，同時蟲草素含量也相應的呈現(xiàn)增加趨勢。其中，在含水量65%、70%、75%時有較大量的蟲草素，分別為1761±129.25 μg/g、2137±31.7 μg/g 和2460±214.1 μg/g。當培養(yǎng)基中含水量增加80%以上時，培養(yǎng)基中蟲草素的積累量出現(xiàn)迅速下降的趨勢，說明過高濃度的含水量并不適宜蟲草素的積累。

圖1 含水量對蟲草素積累量的影響Fig 1 .Effects of moisture content on cordycepin accumulation by SSF

2.2 碳源對蟲草素積累的影響

在65%、70%、75%含水量的固體培養(yǎng)基中不同碳源種類對蟲草素產量的影響結果如圖2 所示。結果表明，淀粉對蟲草素積累量較其他碳源具有優(yōu)勢。且隨著培養(yǎng)基中含水量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在70%含水量時有最大蟲草素積累量2102.4±103.3 μg/g。蔗糖、麥芽糖及甘露醇雖也能促進的蟲草素積累，但由于其原料價較淀粉高，因此實驗中選取淀粉為唯一碳源，加入70%含水量的培養(yǎng)基。

圖2 不同含水量條件下碳源對蟲草素積累量的影響Fig 2 .Effects of various carbon sources on cordycepin accumulation by SSF

碳源濃度優(yōu)化結果如圖3 可知，蟲草素的積累量隨著淀粉添加濃度的升高而升高，在添加量為2%時有最大積累量1873.0±97.67 μg/g，隨后隨著淀粉濃度的上升呈下降趨勢。故實驗中選取2%的淀粉濃度作為輔助碳源的添加濃度。

2.3 氮源對蟲草素積累的影響

實驗過程中，分別選取相同濃度的硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏及豆粕作為唯一氮源加入培養(yǎng)基中，結果如圖4 可知，有機氮類較適宜蟲草素的積累，其中以蛋白胨的效果最好，蟲草素積累量為2179.2±339.98 μg/g，促進作用明顯高于其他幾種有機氮源。硫酸銨作為實驗中添加的無機氮源，雖然也能促進培養(yǎng)基中蟲草素的積累，但其效果均不如有機氮類，因此選擇蛋白胨作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的輔助氮源。

圖3 碳源濃度對蟲草素積累量的影響Fig 3 .Effects of initial carbon concentration on cordycepin accumulation by SSF

圖4 氮源對蟲草素積累量的影響Fig 4 .Effects of various nitrogen sources on cordycepin accumulation by SSF

在氮源濃度優(yōu)化實驗中分別選取0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的蛋白胨濃度進行實驗，結果如圖5 所示，蟲草素的積累量隨著輔助氮源的添加量的增加而增加，其中在蛋白胨的添加濃度為1%時，有蟲草素的積累較大值4330.16±521.71 μg/g，當?shù)鞍纂藵舛壤^續(xù)增大時，蟲草素積累量隨之減少，故實驗選取1%濃度的蛋白胨作為輔助氮源的添加濃度。

圖5 氮源濃度對蟲草素積累量的影響Fig 5 .Effects of initial nitrogen concentration on cordycepin accumulation by SSF

2.4 無機鹽對蟲草素積累的影響

表2 L8(26)正交實驗結果及極差分析表（x±s）Table 2 Results and analysis of orthogonal design for inorganic salts

表3 無機鹽方差分析表T able 3 Analysis of variance for inorganic salts

結果表明，無機鹽對蟲草素積累量的影響表現(xiàn)為FeSO4（E）＞K2HPO4（B）＞CuSO4（D）＞MgSO4·7H2O（C）＞CaCl2（F）＞KH2PO4（A），最佳配比為A2B2C1D1E1F1，即在培養(yǎng) 基中加入0.5 g/L 的KH2PO4和0.5 g/L 的K2HPO4。

因此，最適蟲草素積累的培養(yǎng)基組成為：70%含水量，2%淀粉，1%蛋白胨，0.05% KH2PO4和0.05% K2HPO4。在此培養(yǎng)基條件下有蟲草素積累量5000.48±213.3 μg/g。

3 結論

在蟲草菌固體培養(yǎng)階段，過低或過高的含水量都不利于蟲草素的積累。含水量過低會影響營養(yǎng)物質向細胞的傳輸及菌體形態(tài)；含水量過高則會影響菌體的生長速度，降低菌體對雜菌的抵抗能力，易染菌或導致菌體老化或窒息死亡。

碳源和氮源也是菌體生長中必不可少的重要物質：氮源是合成細菌蛋白質，特別是核蛋白的重要物質，也是細胞核、細胞漿和其他的基本結構的氮的來源。而碳源也是微生物生存、生長發(fā)育、新陳代謝的不可缺少的物質，是構成生物體中有機酸、糖類、DNA、RNA、脂類等的一個主要原料。啤酒糟雖然含有豐富的營養(yǎng)成分，但并不能很快的被菌體吸收利用，通過向固體培養(yǎng)基中加入一定量的輔助碳源及輔助氮源可有助于菌體細胞的生長，利于對酒糟中營養(yǎng)成分的吸收。優(yōu)化結果表明：不同含水量條件下加入相同質量的碳源的蟲草菌素的產量有不同的影響，在70%含水量，2%淀粉，1%蛋白胨，0.05% KH2PO4和0.05% K2HPO4條件下，有較高的蟲草素的積累。

[1]Cuningham K G，Hutchinson S A，Manson W，et al.Cordycepin，a metablic product from cultures of Cordyceps militaris（Linn.）link，PartⅠ:isolation and characterisation[J].Journal of the Chemical Society（Resumed），1951:2299-2300.

[2]張平，朱述鈞，蔣寧，等.北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析[J].江蘇農業(yè)科學，2003，6:106-107.

[3]丁向萍，馬力，魏書堂，等.蟲草素誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡及對端粒酶活性影響的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2008，15（2）:109-113.

[4]Kubo E，Sato A，Yoshikawa N，et al.Effect of cordyceps sinensis on TIMP-1 secretion from mouse melanoma cell[J].Central European Journal of Biology，2012，7（1）:167-171.

[5]Choi S，Lim M H，Kim K M，et al.Cordycepin induced apoptosis and autophagy in breast cancer cells are independent of the estrogen receptor [J].Toxicology and Applied Pharmacology，2011，257（2）:165-173.

[6]韋會平，肖波，胡開治，等.蛹蟲草藥用價值考[J].中藥材，2004，3:15.

[7]Suger A M，McCaffrey R P.Antifungal activity of 3'-deoxyadenosine [J].Antimicrob Agents Chemother，1998，42（6）:1424-1427.

[8]馬力，丁向萍.蟲草素抗腫瘤機制研究進展[J].第四軍醫(yī)大學學報，2009，30（8）:764-766.

[9]潘真清,陳濤.利用啤酒糟深層液體培養(yǎng)風尾菇產木聚糖酶的初步研究[J].安徽工程科技學院學報,2010,25（2）:30-32.

[10]梁向忠,占文輝.啤酒糟種植平菇新技術[J].長江蔬菜,1996（3）:34-35.

[11]朱斌，顏延寧.啤酒糟發(fā)酵牛糞栽培雙孢菇的研究[J].北方園藝,2010（9）:199-200.