周 潔，左利民，王智亮，姜 威，任連杰，山廣志#（.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 00050；.濰坊市人民醫(yī)院，山東 濰坊 604；.北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 0005）

L-谷氨酰胺呱侖酸鈉顆粒（L-glutamine and sodium gualenate granules，商品名：麥滋林）是日本壽制藥株式會(huì)社生產(chǎn)的以L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉為主成分的復(fù)方制劑，主要用于治療口腔潰瘍[1]、胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍[2]等疾病。

因L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉極性不同，且含量相差懸殊，同時(shí)測(cè)定二者含量相對(duì)困難。在L-谷氨酰胺呱侖酸鈉顆粒進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3]中，分別采用定氮法和高效液相色譜（HPLC）法對(duì)L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉的含量進(jìn)行測(cè)定。另有文獻(xiàn)報(bào)道，利用紫外分光光度法[4]、反相高效液相色譜（RP-HPLC）[5]法等方法檢測(cè)呱侖酸鈉含量，采用HPLC法[6]、紙層析法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]等方法以及借助氨基酸自動(dòng)分析儀[9]檢測(cè)L-谷氨酰胺的含量。最近有研究人員采用離子對(duì)HPLC法，以乙腈-0.05%癸烷磺酸鈉溶液為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)了L-谷氨酰胺呱侖酸鈉顆粒中L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉含量的同時(shí)測(cè)定[10]。

毛細(xì)管電泳法以綠色、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于藥物分析的各個(gè)領(lǐng)域，尤其適合帶電物質(zhì)的分離，是傳統(tǒng)RP-HPLC方法的有效補(bǔ)充。本文嘗試采用成本低、柱效高的毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定L-谷氨酰胺呱侖酸鈉顆粒中2種主要成分的含量，以為國(guó)內(nèi)產(chǎn)品的藥品標(biāo)準(zhǔn)提高，以及極性較強(qiáng)且酸堿性相差懸殊的復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)、質(zhì)量研究與控制提供參考和借鑒。

1 材料

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（美國(guó)Beckman Coulter有限公司）；CP214型電子天平（美國(guó)奧豪斯儀器有限公司）；Integral 10型超純水儀（德國(guó)Merck Millipore公司）；無(wú)涂層石英毛細(xì)管柱（河北永年光導(dǎo)纖維廠）；Seven Easy S20 pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

L-谷氨酰胺對(duì)照品（美國(guó)Agilent Technologies有限公司，批號(hào)：BCBG1414V，純度：100.0%）；呱侖酸鈉對(duì)照品（日本壽制藥株式會(huì)社，批號(hào)：I07N，純度：100.6%）；L-谷氨酰胺呱侖酸鈉顆粒樣品（日本壽制藥株式會(huì)社，批號(hào)：S49P、S56Q，規(guī)格：0.67 g/袋，每袋含L-谷氨酰胺663.3 mg、呱侖酸鈉2.0 mg）；十水合四硼酸鈉、硼酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件

色譜柱：采用無(wú)涂層石英毛細(xì)管柱（總長(zhǎng)度60.2 cm，有效長(zhǎng)度50 cm，內(nèi)徑50 μm）；運(yùn)行緩沖液：40 mmol/L硼砂緩沖液（pH＝9.22）；樣品緩沖液：4 mmol/L硼酸緩沖液（pH＝6.97）；溫度：20 ℃；進(jìn)樣方式：壓力進(jìn)樣；進(jìn)樣壓力：0.5 psi；進(jìn)樣時(shí)間：5 s；分離電壓：15 kV；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

試驗(yàn)前石英毛細(xì)管柱分別用0.1 mol/L氫氧化鈉沖洗20 min，超純水沖洗5 min，運(yùn)行緩沖液沖洗5 min，以保證毛細(xì)管柱充分清洗并平衡。每次進(jìn)樣前依次用0.1 mol/L氫氧化鈉、超純水、運(yùn)行緩沖液各沖洗3 min，以保證待測(cè)樣品的重復(fù)性。

2.2 溶液的配制

2.2.1 運(yùn)行緩沖液（空白溶液）的配制 稱取十水合四硼酸鈉380.0 mg，加100 ml超純水溶解，搖勻，調(diào)pH至9.22，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得40 mmol/L運(yùn)行緩沖液。

2.2.2 樣品緩沖液的配制 稱取硼酸120.0 mg，加500 ml超純水溶解，搖勻，調(diào)pH至6.97，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得4 mmol/L樣品緩沖液。

2.2.3 系列混合對(duì)照溶液的制備 稱取呱侖酸鈉對(duì)照品25.0 mg，置于50 ml量瓶中，加樣品緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。稱取L-谷氨酰胺對(duì)照品332.5 mg，置于25 ml量瓶中，精密加入上述呱侖酸鈉溶液2.0 ml，加樣品緩沖液溶解并稀釋至刻度，即得含13.30 mg/mlL-谷氨酰胺與40.0 μg/ml呱侖酸鈉的混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液適量，加樣品緩沖液逐級(jí)稀釋至L-谷氨酰胺質(zhì)量濃度分別為13.30、6.650、3.325、0.665 0、0.332 5 mg/ml，呱侖酸鈉質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、2.00、1.00 μg/ml的系列混合對(duì)照溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 分別稱取批號(hào)為S49P、S56Q的2批L-谷氨酰胺呱侖酸鈉顆粒樣品0.670 0 g，分別置于100 ml量瓶中，加樣品緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過(guò)濾；精密量取5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加樣品緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取空白溶劑（樣品緩沖液）、3.325 mg/mlL-谷氨酰胺與10.0 μg/ml呱侖酸鈉的混合對(duì)照品溶液和批號(hào)為S56Q的供試品溶液，分別注入毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)。色譜見(jiàn)圖1。結(jié)果，L-谷氨酰胺對(duì)照品遷移時(shí)間為6.6 min，呱侖酸鈉對(duì)照品遷移時(shí)間為7.9 min；空白溶液在相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，不干擾L-谷氨酰胺和呱侖酸鈉的測(cè)定。

2.4 線性范圍考察

圖1 毛細(xì)管電泳色譜圖A.空白溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品（S56Q）溶液；1.L-谷氨酰胺；2.呱侖酸鈉Fig 1 Capillary electrophoresis chromatogramsA.blank solution；B.mixed reference solution；C.test sample（S56Q）solution；1.L-glutamine；2.sodium gualenate

取L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉的系列混合對(duì)照溶液適量，分別按“2.1”項(xiàng)下電泳條件進(jìn)樣，記錄色譜峰，以質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得L-谷氨酰胺和呱侖酸鈉的回歸方程為y＝1.34×10－4x－0.12（r＝0.998 3），y＝8.26×10－4x+0.36（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，L-谷氨酰胺和呱侖酸鈉質(zhì)量濃度分別在0.332 5～13.30、1.00～40.0 μg/ml范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限和定量限

以信噪比為10計(jì)算最低定量限（LOQ），以信噪比為3計(jì)算最低檢出限（LOD）。結(jié)果，L-谷氨酰胺的LOQ為66.50 μg/ml，LOD為33.25 μg/ml；呱侖酸鈉的LOQ為1.00 μg/ml，LOD為0.500 μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

取含有5.50 mg/mlL-谷氨酰胺與16.0 μg/ml呱侖酸鈉的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下電泳條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，L-谷氨酰胺峰面積的RSD為2.53%（n＝5），呱侖酸鈉峰面積的RSD為1.55%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一批樣品（批號(hào)：S49P）適量，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下電泳條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，L-谷氨酰胺峰面積的RSD為2.83%（n＝5），呱侖酸鈉峰面積的RSD為1.73%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取“2.2.4”項(xiàng)下供試品溶液5.0 ml（批號(hào)：S49P）共9份，置于10 ml量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為5.50 mg/ml的L-谷氨酰胺與16.0 μg/ml的呱侖酸鈉混合對(duì)照品溶液各1.8、3.0、4.2 ml，加樣品緩沖液稀釋至刻度，搖勻，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份。按“2.1”項(xiàng)下電泳條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取2批供試品（批號(hào)：S49P、S56Q），按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下電泳條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算2批樣品中L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉的含量。結(jié)果，批號(hào)為S49P的供試品中含L-谷氨酰胺占標(biāo)示量的100.3%，含呱侖酸鈉占標(biāo)示量的100.0%；批號(hào)為S56Q的供試品中含L-谷氨酰胺占標(biāo)示量的103.2%，含呱侖酸鈉占標(biāo)示量的109.0%。該結(jié)果與按進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)所得結(jié)果基本一致。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 The result of recovery test（n＝9）

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

L-谷氨酰胺和呱侖酸鈉在水溶液中分別帶正電荷和負(fù)電荷，兩者極性均較大，難以用傳統(tǒng)的RP-HPLC法進(jìn)行分離。本文采用毛細(xì)管電泳法，依靠電泳和電滲兩種作用，利用40 mmol/L硼砂緩沖液（pH＝9.22），使極性相反的L-谷氨酰胺和呱侖酸鈉得到了良好的分離和檢測(cè)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

呱侖酸鈉在246、293、370 nm波長(zhǎng)處均有最大特征吸收峰，通常選擇290 nm作為其檢測(cè)波長(zhǎng)[7]，但L-谷氨酰胺在此波長(zhǎng)下無(wú)紫外吸收。為了滿足呱侖酸鈉與L-谷氨酰胺的同時(shí)測(cè)定，故選擇較低的220 nm波長(zhǎng)作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)，保證了二者響應(yīng)良好，實(shí)現(xiàn)了L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉的同時(shí)檢測(cè)。

3.3 運(yùn)行緩沖液pH的選擇

硼酸鹽緩沖液因pH緩沖范圍較寬、紫外吸收較低而成為毛細(xì)管電泳試驗(yàn)中較常用的分離緩沖體系。本試驗(yàn)結(jié)合L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉的pKa值對(duì)運(yùn)行緩沖液濃度及其pH進(jìn)行選擇和優(yōu)化。最終，選擇40 mmol/L硼砂緩沖液（pH＝9.22）作為本研究運(yùn)行緩沖液。

3.4 樣品緩沖液pH的選擇

利用毛細(xì)管電泳檢測(cè)時(shí)，要求樣品緩沖液電導(dǎo)值≤運(yùn)行緩沖液電導(dǎo)值，以促使電泳區(qū)帶聚焦，獲得良好峰形[13]。本試驗(yàn)利用4 mmol/L硼酸緩沖液（pH＝6.97）作為樣品緩沖液，其濃度為運(yùn)行緩沖液濃度的1/10。樣品緩沖液電導(dǎo)值＜運(yùn)行緩沖液電導(dǎo)值，可使待測(cè)物保持良好峰形；同時(shí)，能確保樣品緩沖液pH與運(yùn)行緩沖液pH保持一定的差異，以利于樣品分離和檢測(cè)。

3.5 分離電壓的選擇

分離電壓可直接影響電滲流、遷移時(shí)間、靈敏度和分離度等因素[13-14]。本試驗(yàn)比較了10、15、20 kV分離電壓對(duì)L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉分離度的影響。結(jié)果表明，隨著分離電壓的增大，L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉的遷移時(shí)間減小，同時(shí)L-谷氨酰胺峰展寬；當(dāng)電壓為15 kV時(shí)，2種成分具有良好的分離度、遷移時(shí)間較短，且基線平穩(wěn)，峰形相對(duì)較好。因此，確定分離電壓為15 kV。

綜上所述，本文建立的毛細(xì)管電泳法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、專屬性強(qiáng)，能夠滿足復(fù)方制劑中L-谷氨酰胺與呱侖酸鈉含量的同時(shí)測(cè)定。

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