肖衛(wèi)紅，楊全偉，何 偉，張 耕（武漢市第一醫(yī)院，武漢 430022）

九味益胃合劑為武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院國(guó)家級(jí)重點(diǎn)專科脾胃病科的臨床處方，是在四君子湯合左金丸基礎(chǔ)上化裁而來(lái)，主要功能為益氣和胃、活血止痛，用于脾胃虛弱、血瘀胃痛、體倦神疲、噯腐吞酸、纏綿反復(fù)。臨床上使用后可提高潰瘍愈合質(zhì)量，與三聯(lián)療法合用可提高幽門(mén)螺桿菌根除率[1]。該方主要由丹參、太子參、赤芍、姜黃連、大黃等9味中藥組成，故命名為九味益胃合劑。為了優(yōu)選其提取工藝，以最節(jié)省的成本來(lái)達(dá)到最優(yōu)提取效果，使其更好地發(fā)揮臨床療效，筆者以方中君藥丹參中水溶性成分丹酚酸B的含量、赤芍中芍藥苷的含量和干膏提取率進(jìn)行加權(quán)評(píng)分作為綜合考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定九味益胃合劑的最優(yōu)提取因素水平。試驗(yàn)方法與結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A系列高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；e2695系列高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；ME215S電子天平（瑞士Sartorius公司，實(shí)際分度值d＝0.01 mg）。

1.2 藥品、藥材與試劑

丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：110715-201016，純度：95.4%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201037，純度：95.4%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹參、太子參、赤芍、當(dāng)歸、姜黃連、仙鶴草、紅花、茯苓、炙甘草（湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，批號(hào)：20130402）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹酚酸B的含量測(cè)定[2]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ODS Hypersil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水-甲酸（7∶25∶67∶1，V/V/V/V），流速：1.0 ml/min；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μl。

2.1.2 溶液制備（1）丹酚酸B對(duì)照品溶液。精密稱取丹酚酸B對(duì)照品13.94 mg，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇，制成每1 ml含0.278 8 mg的溶液即得。（2）供試品溶液。按比例稱取九味益胃合劑處方藥材，用10倍量的水浸泡1 h，水回流提取2次，每次提取1 h，收集所得藥液，濃縮至200 ml，搖勻；精密量取2 ml，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。（3）丹參陰性溶液。稱取不含丹參的其余藥材，按“（2）”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備即得。

2.1.3 方法專屬性試驗(yàn) 吸取上述3種溶液各10μl，進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果，丹酚酸B對(duì)照品和供試品溶液均在18 min左右出現(xiàn)丹酚酸B色譜峰；供試品溶液色譜圖中丹酚酸B色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱性好，與前后其他峰分離度均大于1.5；按丹酚酸B計(jì)，理論板數(shù)大于2 000，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 丹酚酸B高效液相色譜圖A.丹酚酸B對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.丹參陰性溶液；1.丹酚酸BFig 1 HPLC chromatograms of salvianoli acid BA.control solution of salvianoli acid B；B.test solution；C.negative solution of Salvia miltiorrhiza；1.salvianoli acid B

2.1.4 線性關(guān)系考察 取丹酚酸B對(duì)照品溶液，精密取2、3、4、5、10 ml分別至20 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取上述稀釋后溶液及母液分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積（y），以y與對(duì)照品質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝11 143x－23 229（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，丹酚酸B檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為27.88～278.80 μg/ml。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密取丹酚酸B對(duì)照品溶液10 ml置于20 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻；連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于制備后0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，得峰面積的RSD＝0.49%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，測(cè)定丹酚酸B的含量。結(jié)果平均含量為1.966 4 mg/ml（RSD＝0.83%，n＝6），表明本法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，制備成供試品溶液后精密量取1 ml，分別置于50 ml量瓶中，各精密加入適量的丹酚酸B對(duì)照品，加75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液分別進(jìn)樣、測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為97.54%（RSD＝1.85%，n＝6）。

2.2 芍藥苷的含量測(cè)定[2]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ODS Hypersil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14 ∶86，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2.2 溶液制備（1）芍藥苷對(duì)照品溶液。精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加稀乙醇使溶解，制成每1 ml含0.616 mg的溶液即得。（2）供試品溶液[3]。按比例稱取九味益胃合劑處方藥材，用10倍量的水浸泡1 h，水回流提取2次，每次提取1 h，收集所得藥液，濃縮至200 ml，搖勻；精密取3 ml，置于25 ml量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理（功率：240 W，頻率：45 kHz）30 min后取出，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。（3）赤芍陰性溶液。按處方比例稱取缺赤芍藥材，按“（2）”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備即得。

2.2.3 方法專屬性試驗(yàn) 精密吸取上述3種溶液各10μl進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果，芍藥苷對(duì)照品溶液和供試品溶液均在9 min左右出現(xiàn)芍藥苷色譜峰；供試品溶液色譜圖中芍藥苷色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱性好，與前后其他峰分離度均大于1.5；按芍藥苷計(jì)，理論板數(shù)大于2 000，且赤芍陰性溶液無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖2。

圖2 芍藥苷高效液相色譜圖A.芍藥苷對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.赤芍陰性溶液；1.芍藥苷Fig 2 HPLC chromatograms of paeoniflorinA.control solution of paeoniflorin；B.test solution；C.negative solution of Paeonia Radix Rubra；1.paeoniflorin

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密取已制備的各質(zhì)量濃度的芍藥苷對(duì)照品溶液（24、36、48、60、180 μg/ml）分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積（y），以y與對(duì)照品質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝24 014x+57 187（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，芍藥苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為24.64～172.48 μg/ml。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密取對(duì)照品溶液10 ml至20 ml量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。連續(xù)進(jìn)樣6次，記算芍藥苷峰面積RSD＝1.21%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于制備后0、1、2、4、8、12 h時(shí)進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算得芍藥苷峰面積的RSD＝1.46%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，測(cè)定芍藥苷的含量。結(jié)果其平均含量為0.310 mg/ml（RSD＝0.95%，n＝6），表明本法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，制備成供試品溶液。精密量取1 ml，分別置于50 ml量瓶中，各精密加入適量的丹酚酸B對(duì)照品，加75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液分別進(jìn)樣、測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為100.27%（RSD＝1.04%，n＝6）。

2.3 正交試驗(yàn)

[4-6]及預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，針對(duì)藥材的加水倍量、提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、提取次數(shù)等4個(gè)影響因素，以丹酚酸B含量、芍藥苷含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)；以干膏得率（干膏總質(zhì)量/藥材總質(zhì)量×100%）為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)按丹酚酸B含量、芍藥苷含量、干膏得率分別為40、40、20來(lái)計(jì)算綜合評(píng)分，即綜合評(píng)分＝（丹酚酸B含量/丹酚酸B含量最大值）×100×40%+（芍藥苷含量/芍藥苷含量最大值）×100×40%+（干膏得率/干膏得率最大值）×100×20%。

稱取處方比例的藥材共9份，每份121.5 g，按表1因素與水平安排試驗(yàn)，藥材加適量水浸泡、煎煮一定時(shí)間后合并提取液，過(guò)濾濃縮至200 ml，得藥液后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。因素與水平見(jiàn)表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

通過(guò)綜合評(píng)分直觀分析，4個(gè)因素對(duì)丹酚酸B含量、芍藥苷含量、干膏得率的影響程度不同，因素C＞D＞A＞B，最優(yōu)工藝為A3B1C2D3。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，因素C、D對(duì)綜合評(píng)分均有顯著性影響，但由于提取2次與3次對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，從節(jié)約成本方面綜合考慮后，最終確定最優(yōu)工藝為A2B1C2D2，即加8倍量藥材水浸泡1 h，提取2次，每次1 h。根據(jù)最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，3批樣品驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明綜合評(píng)分的RSD＜2%（n＝3），表明提取工藝穩(wěn)定，詳見(jiàn)表4。

3 討論

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of verification test

采用單一考察指標(biāo)優(yōu)選中藥提取工藝并不全面，因單一指標(biāo)并不能完全代表中藥制劑整體質(zhì)量的優(yōu)劣[7]。丹參所含水溶性丹酚酸類成分在抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、調(diào)血脂和細(xì)胞保護(hù)方面作用顯著[8-9]；而赤芍中的芍藥苷為其主要有效成分之一，具有活血化瘀、通脈、抗凝、抗炎、抗過(guò)敏藥效作用[10]，這與該處方的功能主治相一致。故以丹酚酸B與芍藥苷的含量作為丹參和赤芍提取效率的考察指標(biāo)，比較符合中醫(yī)臨床用藥的習(xí)慣以及質(zhì)量控制的要求。

本研究所建立的丹酚酸B和芍藥苷的高效液相色譜含量測(cè)定方法，經(jīng)過(guò)全面的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)和方法學(xué)考察，具有分離度好、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為正交試驗(yàn)優(yōu)選丹酚酸B、芍藥苷水回流提取工藝條件提供了可靠保障。本試驗(yàn)所確定的九味益胃合劑的優(yōu)選提取工藝，具有提取率較高、操作簡(jiǎn)單、便于進(jìn)行大生產(chǎn)的特點(diǎn)，且其批間質(zhì)量穩(wěn)定，故可作為九味益胃合劑的提取工藝方法。

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