黃燕蘭，程道賓，張皆德，肖友生，羅 曼

煙霧病(Moyamoya disease，MMD)又稱腦底異常血管網(wǎng)病，是一種病因不明的慢性進(jìn)行性腦血管狹窄或閉塞性疾病，該病以雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈末端、大腦中動(dòng)脈和大腦前動(dòng)脈的起始段進(jìn)行性狹窄，伴側(cè)枝循環(huán)形成煙霧樣血管為主要特點(diǎn)［1，2］。流行病學(xué)資料表明，煙霧病存在顯著種族和地區(qū)差異，該病主要集中在日本、韓國(guó)、中國(guó)等東亞國(guó)家，而西方國(guó)家的發(fā)病率則相對(duì)較低［3］。日本的研究顯示煙霧病患者中12.1%～14.9%有家族史［4，5］，此外，煙霧病患者后代罹患煙霧病的風(fēng)險(xiǎn)較一般人群高，同卵雙胞胎存在較高的發(fā)病率［6］，這都表明遺傳因素在煙霧病的發(fā)病過(guò)程中起了重要作用。

目前普遍認(rèn)為環(huán)指蛋白213(RNF213)基因是研究煙霧病遺傳易感性的主要候選基因［7，8］，然而在高加索煙霧病患者中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)［9］。在王筱萌等［10］的研究中，64 例漢族煙霧病患者中有3 例發(fā)生rs138130613 位點(diǎn)的變異。雖然rs138130613 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍提示該位點(diǎn)的變異，可能與中國(guó)人的煙霧病患病相關(guān)。來(lái)自廣東省的中國(guó)漢族人群的研究顯示，在校正了年齡、家族史、高血壓、糖尿病、吸煙等混雜因素后，顯性模型下rs138130613 位點(diǎn)與非煙霧病的ICASO 具有相關(guān)性，提示TT 與CT 基因型攜帶者非煙霧病的ICASO的患病風(fēng)險(xiǎn)較高［11］。國(guó)內(nèi)關(guān)于煙霧病的研究對(duì)象主要為中國(guó)漢族人群，故本研究以廣西壯族成人型煙霧病為研究對(duì)象，探討RNF213 基因rs112735431、rs138130613 和rs148731719 位點(diǎn)的多態(tài)性與煙霧病的發(fā)病及其臨床特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013 年10 月-2015 年5 月符合煙霧病診斷的壯族患者52 例，其中男性28 例(53.8%)，女性24 例(46.2%)，平均(41.6 ±11.2)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照日本最新修訂的煙霧病診療指南［12］。選取年齡和性別與煙霧病患者匹配的80 名健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性42 例(52.5%)，女性38 例(47.5%)，平均(40 ±10.4)歲。同時(shí)選取64 例不滿足煙霧病診斷的顱內(nèi)主干動(dòng)脈狹窄患者(non-MMD ICASO-intracranial major artery stenosis/occlusion)與對(duì)照組做比較，其中男性36 例(56.3%)，女性28 例(43.7%)，平均(42.5 ±12.2)歲。non-MMD ICASO 根據(jù)MRA 或CTA 或DSA 影像學(xué)診斷。3 組中所有研究對(duì)象經(jīng)詢問(wèn)確定廣西壯族成年人群。以問(wèn)卷調(diào)查和病歷記錄方法收集所有研究對(duì)象的年齡、性別、民族和相關(guān)臨床資料。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可，所有參加者簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采集所有患者及對(duì)照者外周靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝，參照Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行DNA 提取，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 檢測(cè) 委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計(jì)并合成引物(見(jiàn)表1)。PCR 反應(yīng)體系為40 μl，其中含1.0 μl 的DNA 模板，Mix 溶液20 μl，上下游引物(濃度10 μmol)各1.0 μl，最后加無(wú)酶水17 μl。PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃再延伸6 min。最后上ABI3130 測(cè)序儀，收集到的數(shù)據(jù)用Chromas 軟件進(jìn)行分析。

表1 各基因位點(diǎn)擴(kuò)增引物序列

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分類變量采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法，以比值比(odds ratio，OR)和95% 可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示各基因型及等位基因相對(duì)危險(xiǎn)度。Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)平衡檢驗(yàn)采用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均以雙側(cè)P ＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析 煙霧病組、non-MMD ICASO 和正常對(duì)照組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明3 組研究對(duì)象中性別、年齡相匹配，資料具有可比性。煙霧病組中缺血型26 例(50.0%)，出血型21 例(40.4%)，TIA 患者5 例(9.6%)。non-MMD ICASO 組缺血型44 例(68.8%)，出血型9 例(14.1%)，TIA 患者11 例(18.0%)。

2.2 Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)檢驗(yàn)對(duì)煙霧病、non-MMD ICASO 組和對(duì)照組的RNF213 基因rs112735431、rs138130613 和rs148731719 位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，P 值均大于0.05，確認(rèn)3 組研究樣本是達(dá)到遺傳平衡的群體。

2.3 各位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在3 組間的比較 rs112735431 位點(diǎn)A 等位基因在煙霧病組與正常對(duì)照組、non-MMD ICASO 組與正常對(duì)照組間分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步構(gòu)建顯性遺傳模型分析發(fā)現(xiàn)，攜帶GA 或AA 基因型比攜帶GG 基因型的人發(fā)生煙霧病和顱內(nèi)主干動(dòng)脈狹窄的危險(xiǎn)性增加(分別為OR=12.29，95%CI 1.47～103.10，P=0.006，OR=8.17，95% CI 0.96～69.74，P=0.045)。rs138130613 和rs148731719 位點(diǎn)等位基因及基因型在煙霧病組和non-MMD ICASO 組分別與正常對(duì)照組比較分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表3)。

表3 3 組間RNF213 基因rs112735431、rs138130613 和rs148731719 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較

3 討論

RNF213 基因編碼一種含有5256 個(gè)氨基酸的環(huán)指蛋白，含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可能類似E3 泛素連接酶的作用，參與體內(nèi)泛素化過(guò)程，從而影響細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥、凋亡等生命活動(dòng)［13］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除RNF213 基因的斑馬魚(yú)的頭部血管出現(xiàn)嚴(yán)重異常，表明RNF213 基因參與形成顱內(nèi)血管生成過(guò)程［8］。一項(xiàng)體外試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不給予β-干擾素的內(nèi)皮細(xì)胞中 RNF213 R4810K(rs112735431)過(guò)表達(dá)能夠降低血管再生，而野生型RNF213 的內(nèi)皮細(xì)胞則不能。進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，RNF213 R4810K 的多態(tài)性和炎癥信號(hào)、環(huán)境因素在腦血管缺氧機(jī)制中有重要作用［14］。Kamada 等［7］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RNF213 主要表達(dá)于小鼠的脾臟及粒細(xì)胞等成熟的免疫組織中，而脾池是內(nèi)皮祖細(xì)胞募集分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的主要場(chǎng)所，參與脈管系統(tǒng)的形成。由此推測(cè)，RNF213 基因的多態(tài)性可能通過(guò)影響環(huán)指蛋白在脾臟中的表達(dá)，改變內(nèi)皮祖細(xì)胞的募集和分化，從而影響血管的再生，但其機(jī)制仍不清楚。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，RNF213 基因rs112735431 位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族成人煙霧病及非煙霧病的顱內(nèi)主干動(dòng)脈狹窄相關(guān)，提示著一大部分non-MMD ICASO 患者與煙霧病有著相同的遺傳變異，一些不明原因的ICASO 可能是煙霧病前期。rs138130613及rs148731719 位點(diǎn)基因頻率和基因型與正常人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示 RNF213 基因rs138130613 位點(diǎn)多態(tài)性在廣西壯族人群煙霧病發(fā)病的遺傳因素中可能不起重要作用。這一結(jié)果與前人 的 研 究 結(jié)果 相 似［10，15］。另 幾 項(xiàng) 研 究 結(jié)果 發(fā)現(xiàn)［9，16，17］，不同種族和不同地區(qū)間RNF213 基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因攜帶頻率均存在顯著差異，說(shuō)明RNF213 基因多態(tài)性對(duì)不同種族人群的煙霧病易感性的影響不同，提示著東方和西方國(guó)家煙霧病患者可能有著不同的疾病特點(diǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明雖然存在種族差異及遺傳背景不同，RNF213 基因的多態(tài)性在不同種族特別是亞洲人群煙霧病的遺傳因素中均有重要影響。這種多態(tài)性究竟是與其致病或易感基因連鎖，還是它通過(guò)或協(xié)同其他基因發(fā)揮作用或其本身單獨(dú)發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究，雖然Wang X 等［15］的研究并未發(fā)現(xiàn)在煙霧病患者中存在顯著基因-基因交互作用。

本研究樣本量少，缺乏對(duì)患者的長(zhǎng)期隨訪，無(wú)法評(píng)估患者的預(yù)后。仍需要大樣本量的病例對(duì)照研究或基于家族設(shè)計(jì)的研究來(lái)闡明RNF213 基因的多態(tài)性與煙霧病的發(fā)病、病程、疾病特點(diǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系，其對(duì)煙霧病的活動(dòng)性和家庭成員危險(xiǎn)性的評(píng)估及對(duì)疾病藥物治療還是外科手術(shù)治療的取決都具有重要意義。

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