蔣樹財(cái) ，鄒有瑞，高 鵬，郭 暉，霍國進(jìn)，4，王軍成，4，趙 巍，沈 冰

神經(jīng)膠質(zhì)瘤來自神經(jīng)上皮組織，在顱內(nèi)惡性腫瘤中最為常見，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅著人類的健康。大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene，rHSG)又名線粒體融合基因2(mitofusin-2，Mfn2)，可以顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，其機(jī)制與抑制Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活有關(guān)［1～4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，rHSG 蛋白過表達(dá)可以顯著抑制大鼠膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，但其抗腫瘤機(jī)制尚未深入研究［5，6］。Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)聯(lián)系密切，它的過度激活與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，現(xiàn)今已成為研究抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，且已有實(shí)驗(yàn)性藥物問世［7］，但其與rHSG 抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)研究未見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)針對Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路在rHSG 抗C6 細(xì)胞增殖中的作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 C6 細(xì)胞和Adv-rHSG-GFP、Adv-GFP 病毒純化液由寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液購自美國HyClone 公司;細(xì)胞DNA 含量(細(xì)胞周期)即時(shí)檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司;Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司;Maxima SYBR Green Qpcr Master Mix(2 ×)、First Strand cDNA Synthesis Kit，購自美國Thermo 科技有限公司;小鼠抗大鼠rHSG 單克隆抗體購自美國Abcam 公司;兔抗大鼠H-ras、N-ras、Kras 單克隆抗體購自美國Abcam 公司;兔抗大鼠Erk1/2、p-Erk1/2、Rb、p-Rb 單克隆抗體購自美國CST 公司;小鼠抗大鼠，羊抗大鼠GAPDH 多克隆抗體購自北京全式金生物技術(shù)公司公司;羊抗兔IgG抗體購自中衫金橋生物技術(shù)有限公司，羊抗小鼠、羊抗兔IgG 熒光抗體購自O(shè)dyssey 科技公司;全蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C6 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，復(fù)蘇細(xì)胞后置于含10%的FBS(Hyclone)的高糖DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中，在37 ℃、95% O2/5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 代，細(xì)胞活性恢復(fù)后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將C6 細(xì)胞分空白對照組(PBS)、腺病毒載體對照組(Adv-GFP)、rHSG過表達(dá)組(Adv-rHSG-GFP)3 組;C6 細(xì)胞以1 ×106個(gè)/皿種于60 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h，用含0.2%FBS 的DMEM 同步化24 h;Adv-rHSG-GFP、Adv-GFP 組以劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)得出的最適轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI=100)進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染4 h 后棄去培養(yǎng)液，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h;PBS 組用PBS 緩沖液代替病毒液，4 h 后棄去培養(yǎng)液，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培72 h。

1.2.3 倒置的熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá) 腺病毒轉(zhuǎn)染C6 細(xì)胞24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況后，用胰酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀(BD-FACSVerseTM)檢測綠色熒光的強(qiáng)度，檢測病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 細(xì)胞周期分析 將病毒轉(zhuǎn)染后C6 細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，加入70% 乙醇固定過夜，RNA 酶37 ℃消化30 min，400 目篩網(wǎng)過濾，PI 4 ℃染色30 min，流式細(xì)胞儀(BD-FACSVerseTM)分析細(xì)胞周期。

1.2.5 IGF-1 刺激C6 細(xì)胞 腺病毒轉(zhuǎn)染C6后48 h、72 h，以10 ng/ml 濃度的IGF-1 刺激C6 細(xì)胞15 min 后立即終止刺激(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，IGF-1 以10 ng/ml濃度刺激15 min，能有效激活C6 細(xì)胞的Ras-Raf-MEK-ERK 通路，p-Erk1/2 磷酸化蛋白表達(dá)增多;PBS 組以同樣條件處理)，收集細(xì)胞，以備QRT-PCR 和Western blot 分析。

1.2.6 qRT-PCR 分析 TRIZOL Reagent (Invitrogen)提取IGF-1 刺激后C6 細(xì)胞的總mRAN，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按Thermo 的Maxima SYBR GreeC/ROX Qpcr Master Mix(2 ×)說明書進(jìn)行H-ras、N-ras、Kras、Erk1、Erk2 基因的擴(kuò)增，儀器為BIO-RAD 熒光定量PCR 儀，軟件系統(tǒng)為Bio-Rad CFX MaCager。

1.2.7 Western blot 分析 收集到的細(xì)胞加入適量裂解液裂解，采用BCA 法檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液后95 ℃8 min 使蛋白變性。以30 μg/20 μl體系上樣，進(jìn)行SDS 聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE);PVDF 膜牛奶封閉后，加入rHSG、Hras、N-ras、K-ras、p-Erk1/2、Erk1/2、p-Rb、Rb 蛋白特異性一抗孵育，加入相應(yīng)的二抗雜交;化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)，暗室曝光后Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片成像，或Odyssey Infrared Imaging 儀掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果檢測都重復(fù)3次及3 次以上(n≥3)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，選用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件包分析，同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較使用兩樣本t 檢驗(yàn)，不同組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P ﹤0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上差異。

2 結(jié)果

2.1 倒置熒光顯微鏡下和流式細(xì)胞術(shù)檢測腺病毒轉(zhuǎn)染效率 倒置熒光顯微鏡可觀察到，C6 經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染24 h 后，Adv-GFP 組、Adv-rHSG-GFP 組細(xì)胞在490 nm 藍(lán)色光激發(fā)下有綠色熒光蛋白的強(qiáng)表達(dá);PBS 組并無綠色熒光表達(dá)(見圖1A)。

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，PBS 組作為對照，幾乎沒有細(xì)胞檢測到GFP 蛋白的表達(dá)，Adv-GFP 組中GFP 陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的(91.74 ± 1.08)%，Adv-rHSG-GFP 組中GFP 陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的(96.86 ±1.07)%(見圖1B)。綠色熒光蛋白作為腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后成功表達(dá)的標(biāo)記蛋白(rHSG 與GFP 共表達(dá))，說明C6 細(xì)胞自身沒有綠色熒光蛋白表達(dá)，腺病毒可以高效地將目的基因?qū)隒6 靶細(xì)胞并表達(dá)。

2.2 過表達(dá)rHSG 蛋白的C6 細(xì)胞 Western blot 檢測表明，轉(zhuǎn)染腺病毒48 h、72 h 后各個(gè)分組都有rHSG 蛋白的特異性條帶，但Adv-rHSG-GFP 組較Adv-GFP 組和PBS 組蛋白的特異性條帶明顯增強(qiáng)(P ＜0.01)，Adv-GFP 組和PBS 組之間無顯著差異(P ＞0.05)(見圖2)。說明表明Adv-rHSG-GFP 組C6 細(xì)胞rHSG 蛋白過表達(dá)，而腺病毒空載對照組經(jīng)Adv-GFP 轉(zhuǎn)染后，未見rHSG 過表達(dá)現(xiàn)象。

2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染后C6 細(xì)胞周期分布 流式細(xì)胞儀檢測C6 細(xì)胞DNA 含量(細(xì)胞周期)結(jié)果顯示:PBS 組G0/G1 期 細(xì) 胞 百 分 率 為(46.05 ±3.15)%，腺病毒轉(zhuǎn)染48 h 后，Adv-GFP 組和AdvrHSG-GFP 組G0/G1 期細(xì)胞百分率分別為(47.56 ±1.87)%、(62.79 ±2.01)%;轉(zhuǎn)染72 h 后，兩組細(xì)胞G0/G1 期 細(xì) 胞 百 分 率 分 別 為(47.91 ± 2.50)%、(63.83±1.31)%(見表2、圖3)。PBS 組S 期細(xì)胞百分率為(46.05 ±3.15)%，腺病毒轉(zhuǎn)染48 h 后，Adv-GFP 組和Adv-rHSG-GFP 組S 期細(xì)胞百分率分別為(47.56±1.87)%、(62.79±2.01)%;轉(zhuǎn)染72 h 后，兩組細(xì)胞S 期細(xì)胞百分率分別為(47.91 ±2.50)%、(63.83 ±1.31)%(見表3、圖3)。說明Adv-rHSGGFP 組的C6 細(xì)胞周期受到明顯影響，與PBS 組或Adv-GFP 組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Adv-rHSG-GFP 組停滯于G0/G1 期的細(xì)胞數(shù)量都明顯增加(P ＜0.01)，C6細(xì)胞過表達(dá)rHSG 后其周期被明顯阻滯于G0/G1 期，進(jìn)入S 期的細(xì)胞數(shù)量減少(P ＜0.01);而PBS 組與Adv-GFP 組與相比細(xì)胞周期無顯著變化(P ＞0.05)。

2.4 H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因的mRNA 的表達(dá) qRT-PCR 結(jié)果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導(dǎo)15 min后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因mRNA 表達(dá)量之間并無明顯差異(P ＞0.05)。說明，rHSG 蛋白過表達(dá)對C6 細(xì)胞的H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因的mRNA 表達(dá)量并沒有產(chǎn)生明顯影響(結(jié)果未顯示)。

2.5 Erk1、Erk2 基因的mRNA 的表達(dá) qRTPCR 結(jié)果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導(dǎo)15 min 后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間Erk1、Erk2 基因mRNA 表達(dá)量之間并無明顯差異(P ＞0.05)。說明rHSG 蛋白過表達(dá)對C6 細(xì)胞的Erk1、Erk2 基因的mRNA 表達(dá)量并沒有產(chǎn)生明顯影響(結(jié)果未顯示)。

2.6 H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導(dǎo)15 min后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白特異性條帶強(qiáng)度之間并無顯著差異(P ＞0.05)(見圖4)。說明rHSG 蛋白過表達(dá)對C6 細(xì)胞的H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白表達(dá)量并沒有產(chǎn)生明顯影響。

2.7 Erk1/2 蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導(dǎo)15 min 后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間非磷酸化Erk1/2蛋白特異性條帶強(qiáng)度之間并無顯著差異(P ＞0.05)(見圖5C)。說明rHSG 蛋白過表達(dá)對C6 細(xì)胞的Erk1/2 蛋白表達(dá)量并沒有產(chǎn)生明顯影響。

2.8 rHSG 過表達(dá)對IGF-1 誘導(dǎo)C6 細(xì)胞的Erk1/2 磷酸化的影響 Western blot 檢測結(jié)果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導(dǎo)15 min 后，PBS 組的C6 細(xì)胞p-Erk1/2 磷酸化特異性條帶強(qiáng)度明顯強(qiáng)于未使用IGF-1 誘導(dǎo)的C6 細(xì)胞(P ＜0.01)(見圖5B)，說明IGF-1 誘導(dǎo)使C6 細(xì)胞p-Erk1/2 磷酸化蛋白表達(dá)量明顯升高。10 ng/ml 的IGF-1 誘導(dǎo)15 min 后，PBS 組與Adv-GFP 組之間p-Erk1/2 磷酸化蛋白特異性條帶強(qiáng)度相似，無明顯差異(P ＞0.05);Adv-rHSG-GFP 感染組p-Erk1/2 磷酸化蛋白特異性條帶強(qiáng)度均較PBS組及同一時(shí)間點(diǎn)Adv-GFP 組明顯減弱(P ＜0.01)(見圖5B)。說明rHSG 蛋白過表達(dá)能顯著抑制IGF-1 所誘導(dǎo)的C6 細(xì)胞Erk1/2 蛋白磷酸化。

2.9 磷酸化及非磷酸化Rb 蛋白的表達(dá)Western blot 檢測結(jié)果顯示，未使用IGF-1 誘導(dǎo)的PBS 組與經(jīng)IGF-1 誘導(dǎo)后的PBS 組p-Rb 磷酸化蛋白特異性條帶強(qiáng)度相似，并無明顯差異(P ＞0.05);10 ng/ml 的IGF-1 誘導(dǎo)15min 后，Adv-rHSG-GFP 組p-Rb 磷酸化蛋白特異性條帶均較PBS 組或同一時(shí)間點(diǎn)Adv-GFP 組明顯減弱(P ＜0.01)(見圖5D);各組之間非磷酸化Rb 蛋白表達(dá)特異性條帶強(qiáng)度相似(P ＞0.05)(見圖5E)。說明rHSG 蛋白過表達(dá)能使C6 細(xì)胞p-Rb 磷酸化蛋白表達(dá)降低。

表1 目的基因引物序列

表2 流式細(xì)胞儀檢測C6 細(xì)胞G0/G1 期分布(n=3，)

表2 流式細(xì)胞儀檢測C6 細(xì)胞G0/G1 期分布(n=3，)

與PBS 組比較aP ＜0.01

表3 流式細(xì)胞儀檢測C6 細(xì)胞S 期分布(n=3，)

表3 流式細(xì)胞儀檢測C6 細(xì)胞S 期分布(n=3，)

與PBS 組比aP ＜0.01

圖1 倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測GFP 蛋白的表達(dá)

圖2 Western blot 檢測經(jīng)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染后rHSG 的表達(dá)

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期變化

圖4 Western blot 檢測rHSG 過表達(dá)后C6 細(xì)胞中H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白的表達(dá)

圖5 Western blot 檢測rHSG 過表達(dá)后C6 細(xì)胞中p-Erk1/2、Erk1/2、p-Rb、Rb 蛋白的表達(dá)

3 討論

膠質(zhì)瘤作為高度惡性的原發(fā)性神經(jīng)上皮腫瘤，被定義為細(xì)胞增殖紊亂性疾病，其發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞周期調(diào)控的異常密切相關(guān)。細(xì)胞周期是細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的基本進(jìn)程，其調(diào)控非常精細(xì)，細(xì)胞周期的調(diào)控異常，尤其是G1/S 時(shí)相轉(zhuǎn)換異常是癌變的關(guān)鍵點(diǎn)［8］。近年來，rHSG 作為一個(gè)潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)，其抗腫瘤作用吸引眾多腫瘤研究學(xué)者們的廣泛興趣。rHSG 在多種類型惡性腫瘤細(xì)胞中的抗增殖作用，包括胃癌細(xì)胞系(SGC7901)、肝癌細(xì)胞系(HepG2)、膀胱癌細(xì)胞(T24、5637)，已得到證實(shí)［9～11］。本課題組之前首次證實(shí)了rHSG 抗惡性膠質(zhì)瘤增殖作用［5］，而本實(shí)驗(yàn)通過重組腺病毒載體(Adv-rHSG-GFP)感染大鼠膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞，針對rHSG 的抑癌作用與RASRAF-MEK-ERK 信號(hào)通路的聯(lián)系進(jìn)行了深一步探討。

Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中十分經(jīng)典的也是被研究最清楚的一條，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控中扮演著重要的角色［12，13］。目前國內(nèi)外研究已證實(shí)，多種細(xì)胞因子、生長因子、炎癥因子等細(xì)胞外刺激信號(hào)，可通過相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)路徑，特別是通過激活Ras 原癌基因及其所介導(dǎo)的Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)傳導(dǎo)通路，將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞質(zhì)及其核內(nèi)，引起腫瘤細(xì)胞的過度增殖。當(dāng)細(xì)胞感受到外界絲分裂信號(hào)(如IGF-1等)刺激時(shí)，Ras-Raf-MEK-ERK 通路被激活，p-Erk1/2磷酸化蛋白表達(dá)增加，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白cyclinD 等合成的增加和具有負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)活性的p27Kip1 等CKI 蛋白被通過泛素化途徑降解，CDK/cyclin 復(fù)合物磷酸化成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白R(shí)b(哺乳動(dòng)物細(xì)胞的G1/S 轉(zhuǎn)換的主要調(diào)節(jié)器)的能力增強(qiáng)，p-Rb 磷酸化蛋白表達(dá)增加，非磷酸化Rb 蛋白表達(dá)減少，進(jìn)而釋放出大量的轉(zhuǎn)錄因子E2F1-3，推動(dòng)著細(xì)胞周期由G1 期進(jìn)入S 期，開啟細(xì)胞周期進(jìn)程［14～16］;而相反的，非磷酸化的Rb 蛋白能夠與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子E2F 結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致G1/S 時(shí)相基因無法表達(dá)［17，18］。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，rHSG 過表達(dá)可以抑制Ras-Raf-MEK-ERK 通路的激活，繼而使p-Rb 蛋白表達(dá)的降低，C6 細(xì)胞內(nèi)非磷酸化Rb 蛋白積聚，C6 細(xì)胞周期停滯在G0/G1 期。說明rHSG 基因過表達(dá)抑制C6 細(xì)胞增殖的分子機(jī)制是通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK 通路的激活來介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖的。此外，H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平并沒有發(fā)生顯著變化，說明rHSG 蛋白的過表達(dá)并不調(diào)節(jié)Ras 基因表達(dá)變化，而是可能通過其C-末端片段與Ras 相互作用，N 末端與Ras 的下游效應(yīng)分子Raf-1 相互作用，充當(dāng)Ras 的效應(yīng)分子來抑制RAS-RAF-MEK-ERK 信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮其抗增殖作用的［19］。這與rHSG 在血管平滑肌細(xì)胞［1］、B細(xì)胞淋巴瘤BJAB 細(xì)胞系、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞及結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的作用機(jī)制是一致的。

綜上所述，我們認(rèn)為rHSG 可能通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路的激活抗C6 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)探討了rHSG 的抑癌作用與Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路的聯(lián)系，既是對rHSG 抗膠質(zhì)瘤增殖機(jī)制的進(jìn)一步研究探討，又可以為后續(xù)研究以及其他相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。rHSG 對大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變及其作用機(jī)制至今未研究清楚，還需進(jìn)一步的研究。

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