趙丹華，才麗娜，楊 旭，李繼來，杜繼臣

Pompe 病，又稱糖原累積?、蛐?GSDⅡ)，是一種罕見的常染色體隱性遺傳的溶酶體貯積病，為編碼酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因突變導致溶酶體內糖原分解障礙并廣泛沉積于全身所致［1］。根據(jù)發(fā)病年齡、受累器官及疾病進展情況，可將Pompe病患者分為嬰兒型(infantile-onset Pompe disease，IOPD)及晚發(fā)型(late-onset Pompe disease，LOPD)兩種。典型的IOPD 患者生后數(shù)月即發(fā)病，主要表現(xiàn)為心臟擴大、肌張力低下及呼吸窘迫，2 歲前死亡;而LOPD 患者1 歲后發(fā)病，又可分為兒童型、青少年型及成人型，主要表現(xiàn)為中軸肌及四肢骨骼肌無力，部分伴隨骨骼及心腦血管病變［1～3］。目前臨床上對LOPD 的認識不足，導致許多患者從就診到確診的時間長于5 y［4］。在此，我們對1 例LOPD 患者的臨床表現(xiàn)、病理改變及分子遺傳學基礎進行了詳細的研究。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 23 歲女性，主因“腹脹1 w，加重伴憋氣3 d”就診?；颊哂谌朐呵? w 無明顯誘因出現(xiàn)腹脹、腹圍增加，4 d 后加重，伴胸悶、憋氣，不能平臥。外院查腹部B 超提示腹水(深度5.1 cm);心電圖示:竇性心律，順鐘向轉位，電軸右偏;超聲心動示:右心增大(右房橫徑44 mm，右室橫徑37 mm)伴三尖瓣關閉不全，肺動脈高壓(52 mm-Hg)，左室射血分數(shù)69%，少量心包積液;胸片示:雙下肺紋理增粗、模糊，心影略飽滿。臨床診斷為肺動脈高壓，右心功能不全，給予利尿等治療，癥狀一度好轉，后又加重。為求進一步診治收入我院心內科。入院當日患者神志清楚，無明顯憋氣，自行步入病房。查血氣分析示:pH 7.334，PaO233 mmHg，PaCO284 mmHg，SpO256%，提示Ⅱ型呼吸衰竭。予低流量吸氧、利尿及興奮呼吸等治療無效，患者PaCO2進行性升高，意識水平逐漸下降，復查血氣分析示pH 7.029，PO248 mmHg，PCO2＞130 mmHg，SpO285%。遂立即給予氣管插管，呼吸機輔助呼吸，0.5 h 后神志轉清，復查血氣分析恢復正常。此后患者病情穩(wěn)定，復查超聲心動示右心室大小及肺動脈壓力均降至正常，腹部B 超未見腹水，且呼吸機參數(shù)逐漸下調至可脫機水平，但拔管撤機后患者很快出現(xiàn)明顯的呼吸費力，指尖氧飽和度迅速下降至70%以下，故再次予氣管插管，呼吸機輔助呼吸。此后患者始終維持壓力支持通氣模式(壓力支持8 mmHg，吸入氧濃度30%)，多次嘗試脫機均失敗。

為明確病因，進一步追問病史，發(fā)現(xiàn)患者3 y 前出現(xiàn)雙下肢活動后易疲勞癥狀，緩慢加重，但不影響生活及工作;6 m 前家人發(fā)現(xiàn)其睡眠中呼吸節(jié)律較慢，有張口呼吸及聳肩動作?；颊吒改阜墙H結婚，家族史陰性。神經(jīng)系統(tǒng)查體示四肢近端肌力4 級，遠端5 級，四肢肌容積顯著減少，體質指數(shù)(BMI)13.7 kg/m2。肌酶無異常。干血片法檢測患者外周血GAA 酶活性為5.98 pmol/punch/hr(正常參考范圍20～40 pmol/punch/hr)。

1.2 研究方法

1.2.1 骨骼肌病理檢查 經(jīng)知情同意，對患者行右股四頭肌活體組織檢查。肌肉標本進行常規(guī)組織學和酶組織化學染色，染色方法包括:蘇木精-伊紅(HE)、改良Gomori 染色、高碘酸Schiff 反應(PAS)、油紅“O”脂肪染色、三磷酸腺苷酶、還原型輔酶I 四氮唑還原酶(NADH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細胞色素氧化酶(COX)、非特異性酯酶(NSE)染色。

1.2.2 基因檢查 采集患者4 ml 靜脈血并提取基因組DNA。PCR 反應擴增GAA 基因1～20 號外顯子及其側翼序列，PCR 產(chǎn)物送北京華大中生科技發(fā)展有限公司，用ABI3730XL 型DNA 全自動測序儀進行直接測序。所有PCR 產(chǎn)物均進行雙向測序。對發(fā)現(xiàn)的新突變在100 例正常對照中進行篩查。

1.2.3 逆轉錄 用TRIzol 試劑一步法提取患者總RNA，在M-MLV 逆轉錄酶作用下反轉錄得到第一鏈cDNA。以cDNA 為模板進行PCR 反應，使用Primer 3 設計引物覆蓋第9、10 號外顯子全長及部分11 號外顯子，(正向引物:5'CGTTCAACAAGGATGGCTTC 3’，反向引物5'GTGGGTTCTCCAGCTCATTG 3’)。應用瓊脂糖凝膠檢測PCR 產(chǎn)物并進行雙向測序。

2 結果

骨骼肌主要病理改變?yōu)榧±w維內出現(xiàn)大量嗜堿性空泡，部分空泡內可見PAS 深染物質沉積(見圖1)，未見脂肪滴成分，空泡肌纖維累及兩型，以Ⅱ型肌纖維為主，部分肌纖維內出現(xiàn)NSE 深染物質沉積，上述病理改變提示GSDⅡ可能。

GAA 基因分析顯示，患者第16 號外顯子上存在c.2238G ＞C 突變，為已報道的致病性突變;第10 號內含子存在c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT缺失突變(見圖2)，經(jīng)逆轉錄PCR 證實該突變可以導致mRNA 上第10 號外顯子丟失，其編碼的38 個氨基酸(p.480-517)被跨越，產(chǎn)生截短蛋白(見圖3)，進一步在100 例正常對照者中均未檢測到該缺失突變。

圖1 患者的骨骼肌病理結果

圖2 患者GAA 基因測序分析

圖3 患者逆轉錄PCR 產(chǎn)物凝膠電泳及測序分析

3 討論

本例患者青年發(fā)病，主要表現(xiàn)為嚴重呼吸功能障礙及輕度四肢近端無力，外周血白細胞GAA 酶活性低于正常對照的30%，肌肉活檢顯示空泡性肌病，部分空泡內可見PAS 深染物質沉積，故診斷為LOPD。GAA 基因檢測顯示患者存在c.2238G ＞C及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 復合雜合突變，進一步從基因水平上確診該病。結合其發(fā)病年齡，該患者屬于成年型。

肢帶型肌無力伴呼吸肌力弱是LOPD 患者最常見的臨床表型［3］。本例患者在疾病早期即出現(xiàn)了呼吸衰竭，而肢體運動功能相對保留，提示其呼吸肌受累較四肢骨骼肌更嚴重。有研究表明，部分LOPD 患者以呼吸困難為首發(fā)癥狀，發(fā)病數(shù)年后才喪失行走能力，甚至有個別患者可以通過使用便攜式呼吸機自己步行到醫(yī)院復診［4，5］。由此可見，LOPD 患者呼吸功能障礙突出。但是，也有部分患者首先出現(xiàn)肢體無力，坐輪椅10 余年后方才需要使用呼吸機。因此，LOPD 患者在呼吸肌和骨骼肌受累的順序方面存在很大異質性，其呼吸肌功能與四肢肌力之間無相關性［4，6］。

Pompe 患者的呼吸功能障礙主要表現(xiàn)為限制型通氣障礙，以吸氣肌無力突出，尤其是膈?。?］。膈肌力弱首先表現(xiàn)為臥位肺活量較立位明顯下降，導致夜間低通氣及高碳酸血癥，繼而出現(xiàn)睡眠呼吸障礙、清晨頭痛及白天睡眠過多等不適。本例患者在就診前有入睡后張口呼吸及聳肩等表現(xiàn)，提示當時已存在夜間呼吸困難，但未引起注意。隨著疾病的進展，呼吸肌力逐漸下降，LOPD 患者白天肺活量亦下降，出現(xiàn)低氧血癥、肺心病及呼吸衰竭［8～10］。本患者在就診時亦存在明確的肺動脈高壓、右心功能不全及呼吸衰竭表現(xiàn)，其臨床特點符合該病的發(fā)展規(guī)律。雖然有文獻報道LOPD 患者存在肺靜脈閉塞病(PVOD)，是導致肺高血壓的原因［11］，但本患者的肺動脈收縮壓在糾正了低氧及高碳酸血癥之后降至正常，故推測缺氧等可逆性因素在其肺高血壓的形成過程中發(fā)揮了更大的作用。

脊柱強直綜合征伴低體重是LOPD 患者另一種常見的臨床表型［3］。本例患者僅有BMI 過低，而沒有脊柱強直表現(xiàn)。LOPD 患者出現(xiàn)BMI 過低，推測可能與以下幾種因素有關:疾病本身導致的吞咽困難、胃腸功能障礙、嚴重的肌肉萎縮及呼吸功能障礙。因為長期的呼吸功能不全會導致體內能量的過度消耗，繼而引起B(yǎng)MI 明顯下降，而給予酶替代治療后，隨著肌力的改善，患者BMI 指數(shù)亦增加［12］。但也有文獻報道酶替代治療不能改善LOPD 患者的BMI，并認為BMI 過低是其預后不良的指標之一［11］。

GAA 基因全長28kb，包含20 個外顯子，共編碼952 個氨基酸［2］。目前已報道該基因突變300 余種(www.pompecenter.nl)。本例患者存在c.2238G＞C 及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 復合雜合突變。其中，c.2238G ＞C 點突變?yōu)橐褕蟮赖闹虏⌒酝蛔?，也是中國內地及中國臺灣LOPD 患者的熱點突變［2，13，14］;而c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 缺失突變?yōu)樾峦蛔?，該突變導致mRNA 上第10 號外顯子缺失，其所編碼的38 個氨基酸被跨越。由于p.470-517 位于該蛋白的催化結構域，其后連接活性中心D518，且N470 也是蛋白翻譯后進行糖基化修飾的7 個位點之一［15］，因此推測10 號外顯子缺失將對蛋白的結構和催化功能產(chǎn)生重要影響;同時，在100 例健康對照者均未發(fā)現(xiàn)相同突變，綜合以上分析考慮該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。而剪切突變導致的關鍵結構域的受損，也許是患者病情較重且迅速進展的原因之一。

［1］van der Ploeg AT，Reuser AJ.Pompe's disease［J］.Lancet，2008，372(9646):1342-1353.

［2］Wan L，Lee CC，Hsu CM，et al.Identification of eight novel mutations of the acid alpha-glucosidase gene causing the infantile or juvenile form of glycogen storage disease type Ⅱ［J］.J Neurol，2008，255(6):831-838.

［3］Schüller A，Wenninger S，Strigl-Pill N，et al.Toward deconstructing the phenotype of late-onset Pompe disease［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2012，160C(1):80-88.

［4］Hagemans ML，Winkel LP，Van Doorn PA，et al.Clinical manifestation and natural course of late-onset Pompe's disease in 54 Dutch patients［J］.Brain，2005，128:671-677.

［5］Van der Beek NA，Haqemans ML，Reuser AJ，et al.Rate of disease progression during long-term follow-up of patients with late-onset Pompe disease［J］.Neuromuscul Disord，2009，19(2):113-117.

［6］Mellies U，Ragette R，Schwake C，et al.Sleep-disordered breathing and respiratory failure in acid maltase deficiency［J］.Neurology，2001，57(7):1290-1295.

［7］金巍娜，闕呈立，唐海燕，等.晚發(fā)型糖原貯積?、蛐突颊吆粑δ芘R床研究［J］.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2014，14(5):399-404.

［8］Mellies U，Lofaso F.Pompe disease:a neuromuscular disease with respiratory muscle involvement［J］.Respir Med，2009，103(4):477-484.

［9］Shahrizaila N，Kinnear WJ，Wills AJ.Respiratory involvement in inherited primary muscle conditions［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006，77(10):1108-1115.

［10］Mellies U，Stehling F，Dohna-Schwake C，et al.Respiratory failure in Pompe disease:treatment with noninvasive ventilation［J］.Neurology，2005，64(8):1465-1467.

［11］Kobayashi H，Shimada Y，Ikeqami M，et al.Prognostic factors for the late onset Pompe disease with enzyme replacement therapy:from our experience of 4 cases including an autopsy case［J］.Mol Genet Metab，2010，100(1):14-19.

［12］Ravaglia S，Danesino C，Moglia A，et al.Changes in nutritional status and body composition during enzyme replacement therapy in adult-onset type Ⅱglycogenosis［J］.Eur J Neurol，2010，17(7):957-962.

［13］Liu X，Wang Z，Jin W，et al.Clinical and GAA gene mutation analysis in mainland Chinese patients with late-onset Pompe disease:identifying c.2238G ＞C as the most common mutation［J］.BMC Med Genet，2014，15(1):141.

［14］Yang CC，Chien YH，Lee NC，et al.Rapid progressive course of later-onset Pompe disease in Chinese patients［J］.Mol Genet Metab，2011，104(3):284-288.

［15］Kroos M，Hoogeveen-Westerveld M，van der Ploeg A，et al.The genotype-phenotype correlation in Pompe disease［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2012，160(1):59-68.