黃曉勇　柯愛武　施國明　周儉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科， 上?！?00032)

·論著·

Alpha B-crystallin蛋白Ser磷酸化在肝細胞肝癌中的意義

黃曉勇柯愛武施國明周儉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科， 上海200032)

摘要目的：探討alpha B-crystallin蛋白Ser59磷酸化在肝細胞肝癌(肝癌)組織中的意義。方法： 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測403例肝癌組織中磷酸化的alpha B-crystallin(Ser59)的表達水平，分析其與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果： 磷酸化alpha B-crystallin的表達水平與腫瘤直徑、腫瘤包膜、大血管侵犯及腫瘤組織分化有關(guān)(P<0.05、0.01)，而與肝癌患者年齡、性別、乙肝表面抗原、肝硬化等無關(guān)(P>0.05)。多因素分析結(jié)果顯示，磷酸化alpha B-crystallin的表達水平是肝癌的獨立預(yù)后因素。結(jié)論： 磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)的表達水平與肝癌的惡性表型及不良預(yù)后相關(guān)。

關(guān)鍵詞磷酸化alpha B-crystallin；肝細胞肝癌；預(yù)后

Significance of Phosphorylated Alpha B-Crystallin (Ser59)in Hepatocellular Carcinoma TissuesHUANGXiaoyongKEAiwuSHIGuomingZHOUJianDepartmentofLiverSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To investigate the expression of phosphorylated alpha B-crystallin in hepatocellular carcinoma(HCC) tissues and its significance. Methods： The expression level of phosphorylated alpha B-crystallin in HCC tissues from 403 cases was detected by immunohistochemical staining, and its correlation with HCC clinicopathologic features and prognosis was analyzed. Results： The expression level of phosphorylate alpha B-crystallin (Ser59) was correlated with tumor size, tumor encapsulation, vascular invasion and tissue differentiation(P<0.05 or 0.01). However, it was not correlated with age, gender, HBsAg, liver cirrhosis. Multivariate analysis showed that the expression level of phosphorylated alpha B-crystallin (Ser59) was an independent factor for prognosis. Conclusions： The expression level of phosphorylated alpha B-crystallin (Ser59) is correlated with the malignant phenotype and poor prognosis of HCC.

Key WordsPhosphorylated alpha B-crystallin；Hepatocellular carcinoma；Prognosis

肝細胞肝癌(簡稱肝癌)是國內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，肝癌侵襲轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是患者病死的主要原因之一[1]。因此，探索肝癌侵襲轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的發(fā)生機制，并尋求抗肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的有效措施，對改善肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。在人類中，10種不同的小熱休克蛋白(small heat shock proteins，sHSPs)已被特征化，其中HSP27、HSP22和alpha B-crystallin等在細胞應(yīng)對壓力刺激時表達增加。在乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、子宮內(nèi)膜癌和白血病患者中，sHSPs表達水平升高[2]。alpha B-crystallin基因定位于人染色體11q22.3-23.11，長度為528 bp。alpha B-crystallin能夠保護細胞，抑制凋亡，并且在多種腫瘤中高表達[3]。近年來，alpha B-crystallin的磷酸化受到重視，其可能參與不依賴Ras的Raf及下游信號激活。alpha B-crystallin可在絲氨酸19、45、59位點發(fā)生磷酸化，而起主要功效的磷酸化位點為絲氨酸59(Ser59)[4]。前期研究[5]結(jié)果表明，alpha B-crystallin能促進肝癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移，但尚無研究探討磷酸化alpha B-crystallin與肝癌的關(guān)系。本研究擬檢測磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)在肝癌組織中的水平，明確其與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2000年1月—2002年9月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科行肝癌切除術(shù)的403例肝癌患者的癌組織石蠟標(biāo)本。將403例肝癌組織制成組織芯片(由上海芯超生物科技有限公司提供技術(shù)支持)。肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤的分化按照Edmondson分級標(biāo)準(zhǔn)；所有病例均有完整隨訪資料。隨訪截至2007年3月，患者無瘤生存期為從手術(shù)日期到復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或隨訪截止日期；總生存時間為從手術(shù)時間至隨訪截止時間。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且均獲得患者知情同意。

1.2試劑兔抗人磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)多克隆抗體(美國Novus公司)；SP試劑盒(上海長島生物技術(shù)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)試劑(上海長島生物技術(shù)有限公司)；二甲苯、3%過氧化氫、無水乙醇、1%鹽酸乙醇(上海元象醫(yī)療器械有限公司)；蘇木精液、水溶性封片劑(丹麥Dako公司)。

1.3免疫組織化學(xué)染色制備組織芯片，切片在80 ℃烤箱放置2 h；組織芯片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)浸洗；將芯片置入pH 6.0的檸檬酸溶液中，放入高壓鍋中煮沸，待其沸騰后蓋加壓閥，開鍋2 min后停止加熱，冷卻至室溫，取出芯片，用PBS溶液浸洗；將芯片置入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，取出后用PBS溶液浸洗；將芯片用牛血清白蛋白封閉，室溫下放置30 min；甩去血清，向芯片滴加一抗[抗磷酸化alpha B-crystallin(1∶200)]，4 ℃冰箱孵育過夜；PBS浸洗，向芯片滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS浸洗；向芯片滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS浸洗；滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，自來水浸洗中止顯色，蘇木精復(fù)染30 s，水洗返藍20 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)的判定以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件判斷磷酸化alpha B-crystallin的表達水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間差異比較采用t檢驗或方差檢驗。繪制Kaplan-Meier累積復(fù)發(fā)曲線和總生存曲線，無瘤生存時間和總生存時間差異的檢驗采用Log-rank法，采用Cox回歸模型進行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1磷酸化alpha B-crystallin表達水平與肝癌臨床病理特征的關(guān)系磷酸化alpha B-crystallin陽性染色主要定位于肝癌細胞胞質(zhì)，見圖1。403例肝癌組織中，磷酸化alpha B-crystallin高表達241例，占59.8%。磷酸化alpha B-crystallin表達水平與肝癌患者腫瘤直徑、腫瘤包膜、大血管侵犯、腫瘤組織分化有關(guān)(P<0.05、0.01)；而與年齡、性別、乙肝表面抗原、肝硬化等無關(guān)(P>0.05)。見表1。

A：高表達；B：低表達

項目低表達(n=162)高表達(n=241)P值年齡/歲0.155 ≤5089(54.9)114(47.3) >5073(45.1)127(52.7)性別1.000 女性20(12.3)30(12.4) 男性142(87.7)211(87.6)乙肝表面抗原0.559 陰性27(16.7)46(19.1) 陽性135(83.3)195(80.9)肝硬化0.360 無26(16.0)48(19.9) 有136(84.0)193(80.1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/(U/L)0.394 <75149(92.0)215(89.2) ≥7513(8.0)26(10.8)腫瘤直徑/cm0.007 ≤5107(66.0)126(52.3) >555(34.0)115(47.7)包膜0.010 無107(66.0)128(53.1) 有55(34.0)113(46.9)大血管侵犯0.001 無160(98.8)220(91.3) 有2(1.2)21(8.7)腫瘤數(shù)目0.612 單個132(81.5)191(79.3) 多發(fā)30(18.5)50(20.7)分化0.033 Ⅰ/Ⅱ116(71.6)147(61.0) Ⅲ/Ⅳ46(28.4)94(39.0)

2.2磷酸化alpha B-crystallin表達水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系403例肝癌患者術(shù)后1、3、5年無瘤生存率與總生存率分別為77%、51%、38%和89%、67%、50%。磷酸化alpha B-crystallin高表達組與低表達組術(shù)后1、3、5年總生存率分別為83.8%、54.8%、41.7%和95.7%、84.0%、68.3%；兩組術(shù)后1、3、5年無瘤生存率分別為79.8%、52.9%、44.6%和90.0%、74.3%、50.5%，見圖2。

圖2　Kaplan-Meier曲線分析磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)表達水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

注：P-Cryablow：磷酸化alpha B-crystallin低表達組；P-Cryabhigh：磷酸化alpha B-crystallin高表達組

單因素分析結(jié)果表明，影響肝癌患者總生存時間的因素有肝硬化、腫瘤包膜、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、大血管侵犯、磷酸化alpha B-crystallin表達水平；而影響無瘤生存期的因素有肝硬化、大血管侵犯、腫瘤數(shù)目、磷酸化alpha B-crystallin表達水平。見表2。

表2　肝癌患者總生存時間及無瘤生存期的單因素分析

注：HR：風(fēng)險比；95%CI：95%可信區(qū)間

2.3Cox回歸模型多因素分析根據(jù)單因素分析結(jié)果，將肝硬化、腫瘤包膜、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、大血管侵犯、磷酸化alpha B-crystallin表達水平引入Cox回歸模型進行多因素分析，應(yīng)用后退法逐步篩選因子，結(jié)果顯示肝硬化、腫瘤直徑>5 cm、多發(fā)性肝癌、大血管侵犯、磷酸化alpha B-crystallin高表達是影響總生存時間的獨立預(yù)后因素；肝硬化、大血管侵犯、多發(fā)性肝癌、磷酸化alpha B-crystallin高表達是影響無瘤生存期的獨立預(yù)后因素，見表3。

3討論

alpha B-crystallin作為sHSPs家族的一員，與多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究對用403例肝癌標(biāo)本制作的肝癌組織芯片中磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)表達水平與肝癌預(yù)后的相關(guān)性進行研究。結(jié)果顯示，高表達磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)的肝癌患者預(yù)后比低表達組差。磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)的表達水平與腫瘤直徑、腫瘤無包膜、大血管侵犯、腫瘤組織分化相關(guān)，以上結(jié)果表明磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)與肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表3　影響肝癌患者總生存時間及無瘤生存期的多因素分析

注：HR：風(fēng)險比；95%CI：95%可信區(qū)間

在多種惡性腫瘤中，sHSPs的表達與腫瘤的分期相關(guān)。alpha B-crystallin在神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤(如星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤)和乳腺癌中高表達[6]。sHSPs在腫瘤中高表達的機制還不清楚，可能與腫瘤細胞缺氧或營養(yǎng)壓力造成的細胞不良環(huán)境有關(guān)，或者與致癌性突變通過引起更多的分子伴侶的激活來去除不正常聚集蛋白變異有關(guān)。此外，轉(zhuǎn)錄因子的突變引起更多sHSPs的激活和假低氧狀態(tài)，這也可能導(dǎo)致sHSPs在腫瘤中的表達增加[7-8]。

不管機體處于應(yīng)激狀態(tài)還是正常生理狀態(tài)，alpha B-crystallin均參與復(fù)雜和重要的生物學(xué)過程[2]，如alpha B-crystallin可以作為分子伴侶阻止蛋白間不必要的相互作用、幫助變性蛋白重新折疊、誘導(dǎo)生物體耐熱性、穩(wěn)定細胞骨架、參與細胞的損傷與修復(fù)，在生物體的生長、發(fā)育、進化以及維持機體的生理狀態(tài)和某些疾病的病理生理過程中均發(fā)揮重要作用。sHSPs通過與細胞內(nèi)各組分(蛋白質(zhì)、細胞核、細胞骨架元件、膜)相互作用來維持細胞的穩(wěn)定。磷酸化alpha B-crystallin是alpha B-crystallin的活化結(jié)構(gòu)。據(jù)報道，alpha B-crystallin可通過磷酸化的Ser59結(jié)合Bcl-2進而起到抗腫瘤細胞凋亡的作用[9]。本研究結(jié)果表明磷酸化alpha B-crystallin(Ser59)可作為肝癌的獨立預(yù)后因素，提示alpha B-crystallin 磷酸化參與肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過程。

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中圖分類號R735.7

文獻標(biāo)識碼

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(編號：81272295)