馮莉　廉偉　謝蘊

(復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院消化內(nèi)科， *病理科， 上?！?01199)

·論著·

LMX1A抑制胃癌細(xì)胞系MKN45的生長和成瘤能力的研究

馮莉廉偉謝蘊*

(復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院消化內(nèi)科，*病理科， 上海201199)

摘要目的：探討轉(zhuǎn)錄因子LMX1A(LIM homeobox transcription factor 1, alpha)對胃癌細(xì)胞系MKN45的生長及成瘤能力的影響。方法： 在胃癌細(xì)胞系MKN45中過表達(dá)LMX1A，檢測空載或LMX1A過表達(dá)MKN45的生長及其在小鼠皮下的成瘤能力。結(jié)果：LMX1A誘發(fā)MKN45凋亡的同時抑制其生長并且能夠顯著抑制MKN45在小鼠皮下的成瘤能力(P<0.05)。結(jié)論：LMX1A作為腫瘤抑制因子在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞LMX1A；胃癌；MKN45

Study of LMX1A Inhibiting Growth and Tumorigenic Ability of MKN45 Gastric Cancer Cell LineFENGLiLIANWeiXIEYun*DepartmentofGastroenterology,*DepartmentofPathology,TheCentralHospitalofMinhangDistrict,FudanUniversity,Shanghai201199,China

AbstractObjective：To investigate the effect of LMX1A on growth and tumorigenic ability of MKN45 gastric cancer cell line. Methods:LMX1A was overexpressed in MKN45 gastric cancer cell line. And the proliferation and subcutaneous tumorigenic ability of MKN45 cell line with empty vector or overexpressed LMX1A in mice were detected. Results: LMX1A could induce the apoptosis of MKN45 and meanwhile inhibit its proliferation (P<0.05). Furthermore, overexpression of LMX1A could significantly inhibit subcutaneous tumorigenic ability of MKN45 cells in mice (P<0.05). Conclusions: LMX1A is a tumor suppressor in the development and progression of gastric cancer.

Key WordsLMX1A；Gastric cancer；MKN45

轉(zhuǎn)錄因子LMX1A (LIM homeobox trans-cription factor 1, alpha) 是包含LIM同源盒的基因家族的成員之一，它位于染色體1q24.1[1-2]。之前對敲除LMX1A基因小鼠的研究[3]發(fā)現(xiàn)，LMX1A是決定細(xì)胞分化命運的關(guān)鍵因子。在處于發(fā)育階段的小腦中，LMX1A的缺失幾乎完全阻滯了脊柱中神經(jīng)管的發(fā)生[4]。LMX1A在腫瘤中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。比如，LMX1A能夠抑制宮頸癌的轉(zhuǎn)移[5]。LMX1A基因甲基化程度在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中比正常宮頸組織中高[6]。Dong等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中LMX1A基因的啟動子區(qū)發(fā)生高度甲基化，使LMX1A在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，并且LMX1A在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中發(fā)揮腫瘤抑制作用。本研究探討了LMX1A對胃癌細(xì)胞系MKN45的生長及其成瘤能力的影響，以明確LMX1A的腫瘤抑制作用。

1資料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系MKN45購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法得到LMX1A cDNA，用特異性引物擴(kuò)增后連入pCMV4-flag載體，得到pCMV4-flag-LMX1A質(zhì)粒。

1.3蛋白質(zhì)印跡用預(yù)先加有蛋白酶抑制劑Cocktail(美國Sigma公司)的哺乳動物細(xì)胞總蛋白抽提試劑(美國Pierce公司)從細(xì)胞中提取蛋白，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實驗[7]。

1.4細(xì)胞凋亡檢測用胰酶消化細(xì)胞后離心，收集并懸浮于結(jié)合緩沖液中，然后分別加入膜聯(lián)蛋白(Annexin-Ⅴ，美國BD Pharmingen公司)和碘化丙啶(propidium iodide，PI，美國BD Pharmingen公司)，室溫標(biāo)記15 min，用流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)收集熒光信號。

1.5克隆形成實驗在6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿底部鋪一層0.6%低熔點瓊脂糖，然后將含有1×103細(xì)胞的0.3%瓊脂糖混懸后鋪于其上。4周后，以直徑>1 mm為準(zhǔn)計算克隆數(shù)量。

1.6皮下腫瘤形成實驗10只BALB/C裸鼠(購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心)分別皮下注射1×106轉(zhuǎn)染pCMV4-flag-LMX1A質(zhì)?；騪CMV4-flag質(zhì)粒(空載)的MKN45細(xì)胞，每種細(xì)胞接種5只小鼠。腫瘤大小以公式V=4/3π×L/2×(W/2)2計算得出，其中L代表中軸長，W代表中軸寬[7]。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用Student’st-test，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1LMX1A在胃癌細(xì)胞系MKN45中過表達(dá)構(gòu)建pCMV4-flag-LMX1A質(zhì)粒(LMX1A過表達(dá)質(zhì)粒)并轉(zhuǎn)染MKN45，觀察LMX1A表達(dá)增強對胃癌細(xì)胞系MKN45的影響，以pCMV4-fla質(zhì)粒(空載質(zhì)粒)作為對照。圖1示LMX1A在MKN45中成功表達(dá)。

圖1將pCMV4-flag質(zhì)粒(空載)和pCMV4-flag-LMX1A質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入MKN45細(xì)胞中，得到空載細(xì)胞系MKN45-vector和LMX1A過表達(dá)細(xì)胞系MKN45-LMX1A，并用蛋白質(zhì)印跡法檢測flag-LMX1A表達(dá)情況

2.2LMX1A過表達(dá)負(fù)調(diào)控胃癌細(xì)胞系MKN45的存活等量的細(xì)胞經(jīng)過Annexin-Ⅴ和PI分別標(biāo)記后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LMX1A過表達(dá)細(xì)胞中Annexin-Ⅴ單陽性細(xì)胞的比例顯著增加，而PI單陽性以及Annexin-Ⅴ和PI雙陽性的細(xì)胞比例沒有增加，見圖2A。LMX1A過表達(dá)使MKN45細(xì)胞凋亡增加(P<0.05)，見圖2B。

圖2空載細(xì)胞系MKN45-vector和LMX1A過表達(dá)細(xì)胞系MKN45-LMX1A進(jìn)行Annexin-Ⅴ和PI雙標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀檢測熒光信號(A)，并對3次實驗的熒光強度進(jìn)行統(tǒng)計，計算細(xì)胞凋亡率(B，Student’st-test；與MKN45-vector比較，#P<0.05)

2.3LMX1A過表達(dá)負(fù)調(diào)控胃癌細(xì)胞系MKN45的增殖通過克隆形成實驗對空載和LMX1A過表達(dá)的MKN45細(xì)胞的生長情況進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對于空載細(xì)胞，LMX1A過表達(dá)細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(P<0.05)，見圖3。

圖3空載細(xì)胞系MKN45-vector和LMX1A過表達(dá)細(xì)胞系MKN45-LMX1A分別進(jìn)行克隆形成實驗(A)，并對3次實驗的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(B，Student’st-test, 與MKN45-vector比較，#P<0.05)

2.4LMX1A過表達(dá)負(fù)調(diào)控胃癌細(xì)胞系MKN45的成瘤作用小鼠皮下腫瘤形成實驗結(jié)果顯示，LMX1A過表達(dá)的MKN45細(xì)胞的成瘤能力明顯低于空載細(xì)胞，見圖4。

圖4將空載細(xì)胞系MKN45-vector和LMX1A過表達(dá)細(xì)胞系MKN45-LMX1A分別注射入裸鼠皮下。4周后觀察皮下成瘤體積的差異(A)，測量后進(jìn)行統(tǒng)計(B，Student’st-test, 與MKN45-vector比較，#P<0.05)

3討論

胃癌占全球腫瘤死因的第二位[8]。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蔬菜和水果攝入不足以及幽門螺旋桿菌感染等和胃癌的發(fā)生相關(guān)，但是目前胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制還有待進(jìn)一步研究[9]。

LMX1A作為轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子被報道參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如Twist[10]、Snail[11-12]及Elf5[13]等，但LMX1A在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不明確。前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，由于甲基化程度增加，LMX1A在胃癌組織中的表達(dá)較癌旁組織低。而且無論是在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS[7]中還是本研究應(yīng)用的胃癌細(xì)胞系MKN45中，LMX1A的過表達(dá)都能夠在引起細(xì)胞凋亡的同時抑制細(xì)胞生長，并抑制裸鼠皮下腫瘤的生成。以上結(jié)果證實，LMX1A在不止一種胃癌細(xì)胞系中具有腫瘤抑制作用，提示LMX1A在胃癌組織中表達(dá)的下降有利于腫瘤的發(fā)生。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展包括腫瘤細(xì)胞的存活、生長和轉(zhuǎn)移等，而本研究只關(guān)注了LMX1A對胃癌細(xì)胞的存活和生長的影響，今后，我們將研究LMX1A對胃癌轉(zhuǎn)移的作用傾向。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ]Hobert O,Westphal H.Functions of LIM-homeobox genes[J].Trends Genet,2000,16(2):75-83.

[ 2 ]Dawid IB,Breen JJ,Toyama R.LIM domains:multiple roles as adapters and functional modifiers in protein interactions[J].Trends Genet,1998,14(4): 156-162.

[ 3 ]Chizhikov VV,Lindgren AG,Mishima Y,et al.Lmx1a regulates fates and location of cells originating from the cerebellar rhombic lip and telencephalic cortical hem[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(23):10725-10730.

[ 4 ]Cai J,Donaldson A,Yang M,et al.The role of Lmx1a in the differentiation of human embryonic stem cells into midbrain dopamine neurons in culture and after transplantation into a Parkinson's disease model[J].Stem Cells,2009,27(1): 220-229.

[ 5 ]Liu CY,Chao TK,Su PH,et al.Characterization of LMX-1A as a metastasis suppressor in cervical cancer[J].J Pathol,2009,219(2):222-231.

[ 6 ]Lai HC,Lin YW,Huang TH,et al.Identification of novel DNA methylation markers in cervical cancer[J].Int J Cancer,2008,123(1):161-167.

[ 7 ]Dong W,Feng L,Xie Y,et al.Hypermethylation-mediated reduction of LMX1A expression in gastric cancer[J].Cancer Sci,2011,102(2):361-366.

[ 8 ]Cheng YY,Yu J,Wong YP,et al.Frequent epigenetic inactivation of secreted frizzled-related protein 2(SFRP2) by promoter methylation in human gastric cancer[J].Br J Cancer,2007,97(7):895-901.

[ 9 ]Meireles SI,Carvalho AF,Hirata R,et al.Differentially expressed genes in gastric tumors identified by cDNA array[J].Cancer Lett,2003,190(2): 199-211.

[10]Yang J,Mani SA,Donaher JL,et al.Twist,a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis[J].Cell,2004,117(7):927-939.

[11]Batlle E,Sancho E,Francí C,et al.The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells[J].Nat Cell Biol,2000, 2(2):84-89.

[12]Cano A,Pérez-Moreno MA,Rodrigo I,et al.The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression[J].Nat Cell Biol,2000,2(2):76-83.

[13]Chakrabarti R,Hwang J,Andres Blanco M,et al.Elf5 inhibits the epithelial-mesenchymal transition in mammary gland development and breast cancer metastasis by transcriptionally repressing Snail2[J].Nat Cell Biol,2012, 14(11):1212-1222.

基金項目：上海市自然科學(xué)基金項目(編號：10ZR1426300、134119b2600)

中圖分類號R 735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A