武永福

(隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽 745000)

通過水浴浸提法對(duì)黃花菜中的多糖物質(zhì)進(jìn)行提取，考察了提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)多糖得率的影響，得出最佳提取工藝條件，用苯酚—硫酸法測定提取黃花菜的多糖，公式理論計(jì)算的多糖含量與提取的慶陽黃花菜多糖進(jìn)行比較，求出用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的換算因子，對(duì)傳統(tǒng)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行改進(jìn)，從而使測定黃花菜中的多糖含量變得更為準(zhǔn)確、方便［1-11］。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黃花菜從甘肅省慶陽市購得。石油醚(天津富宇精細(xì)化工有限公司)、95%乙醇(西安三浦精細(xì)化工廠)、丙酮(西安化學(xué)試劑廠)、苯酚(天津紅巖化學(xué)試劑廠)、濃硫酸(西安化學(xué)試劑廠)、葡萄糖(天津市新純化學(xué)試劑研究所)，以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為一次蒸餾水。

1.2 儀器

7230 可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器廠)、數(shù)字式恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)、電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器總廠)、循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量測定［2-11］

苯酚—硫酸試劑與游離寡糖、己糖、糖醛酸起顯色反應(yīng)，己糖在490nm 處，戊糖及糖醛酸在480nm 有最大吸收，在一定范圍內(nèi)，吸光度值與糖含量呈線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光度值可確定樣品多糖含量。

(1)5%苯酚液配制:稱取苯酚12.5g，置于250mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，避光冷藏。

(2)標(biāo)液配制:稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)品20mg，定容至500mL。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取標(biāo)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用水補(bǔ)至1.0mL，加5%苯酚0.6mL，再加濃硫酸3.6mL，混勻，沸水加熱30min，冷后490nm測吸光度，繪制葡萄糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)樣品多糖含量測定:移取20mL 多糖提取液，定容至250mL，按改良苯酚—硫酸法測吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖含量。

(5)計(jì)算公式如(1)式:

(1)式中，X 為樣品多糖含量(%);V 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上葡萄糖體積數(shù)(mL);d 為稀釋倍數(shù);M 為黃花菜樣品質(zhì)量(mg)。

1.4 水浴法浸提黃花菜多糖［12-20］

1.4.1 水浴浸提工藝

原料→清洗→熱風(fēng)烘干→磨碎過篩→石油醚脫脂→水浴浸提3 次→過濾→合并濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→加乙醇→離心→收集沉淀→加水復(fù)溶→加乙醇→離心→沉淀用無水乙醇或丙酮洗滌3 次→水浴干燥得黃花菜多糖晶體→稱重。

1.4.2 操作要點(diǎn)［12-21］

(1)熱風(fēng)烘干:用烘箱在60℃對(duì)洗凈的黃花菜烘干，直至黃花菜質(zhì)量不再減輕為止。(2)磨碎過篩:過篩目數(shù)過高，會(huì)給以后的抽濾帶來困難。(3)石油醚脫脂:索氏抽提回流至石油醚提取液無色為止。(4)加乙醇:加濃縮液5 倍體積的95%乙醇，靜置過夜。(5)離心:用3 500 r/min，離心20min，取其上清液。(6)洗滌烘干稱重:沉淀洗滌后所得多糖晶體在60～70℃烘箱干至質(zhì)量不變，稱重。

1.4.3 水浴浸提工藝條件正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

影響多糖得率的因素很多，主要因素有:浸提溫度(A)、浸提時(shí)間(B)和料液比(C)，每因素取3 個(gè)水平，采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，詳見三因素三水平正交試驗(yàn)表L9(33)。

1.4.4 換算因子的計(jì)算

將提出的黃花菜多糖進(jìn)行準(zhǔn)確稱重，得到的重量與用苯酚—硫酸法測定出的多糖含量進(jìn)行比較，計(jì)算出用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定黃花菜多糖的換算因子。

計(jì)算公式如(2)式:

(2)式中，f:為換算因子;m 為提取出的黃花菜多糖質(zhì)量(mg);M 為黃花菜樣品的質(zhì)量(mg);X 為樣品中多糖的含量(%)［8-21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)樣品多糖得率的影響

相同質(zhì)量(5g)脫脂黃花菜，固定浸提溫度60℃，浸提2h，浸提料液比分別取1∶10、1∶15、1∶20、1∶30，測其吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對(duì)黃花菜多糖得率的影響

由圖1 可知，料液比低于1∶15 時(shí)提取率隨料液比的增大而明顯增加;當(dāng)料液比大于1∶15 時(shí)提取率隨著料液比的增大而稍減少。所以，本次試驗(yàn)選取1∶15 的料液比較為合適。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)黃花菜多糖得率的影響

分別取相同質(zhì)量的黃花菜(5g)，固定提取溫度60℃、料液比為1∶15，浸提時(shí)間分別取2、4、6、8h，測其提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)提取率得的影響

由圖2 可以看出，時(shí)間在2～4h 內(nèi)，黃花菜多糖提取率增長較快;在4～8h 內(nèi)，提取率人有提高，但增幅較小，提高并不顯著，從生產(chǎn)成本上考慮，選取6h 的提取時(shí)間較為合理。

2.1.3 提取溫度對(duì)黃花菜多糖提取率的影響

分別取相同質(zhì)量的黃花菜(5g)，固定提取時(shí)間4h、料液比1∶15，浸提溫度分別為60、70、80、90℃，測其提取率，其結(jié)果見圖3。

圖3 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖3 可知，在70～90℃間，提取率隨浸提溫度升高而增加，但提取率增加不顯著，從生產(chǎn)成本角度考慮，浸提溫度80℃較合理。

2.2 熱水提取最佳工藝條件確定

正交設(shè)計(jì)因素水平見表4。

表4 正交設(shè)計(jì)因素水平

由正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果可知，影響多糖得率的諸因素的主次關(guān)系依次是提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)。最佳組合為A3B3C3，即提取溫度80℃、浸提時(shí)間6h、料液比1∶15 時(shí)，提取的黃花菜多糖液的吸光度為2.566 (表5)。

2.3 用苯酚一硫酸法測定黃花菜多糖含量

由表6 可得，回歸方程為:y=0.468x +0.083 5，R2=0.999 8。

表5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度的關(guān)系

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，將采用最佳工藝條件A3B3C3提取的多糖濾液，采用苯酚—硫酸法測定其在490nm 處的吸光度，其吸光度為0.586，根據(jù)公式計(jì)算出黃花菜多糖的含量。

2.4 黃花菜多糖的提取

精確稱取30g 黃花菜粉末，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定提取溫度為80℃、提取料液比為1∶15、提取時(shí)間6h。然后抽濾提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加約5 倍體積95%乙醇，靜置過夜，沉淀過濾后60℃干燥，直到恒重為止，取出準(zhǔn)確稱重。

2.5 換算因子的計(jì)算

將提出的黃花菜多糖進(jìn)行準(zhǔn)確稱重，得到3.3760g的黃花菜多糖，根據(jù)公式計(jì)算出換算因子為4.2。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中采取熱水提取法對(duì)黃花菜多糖進(jìn)行提取，通過單因素和正交試驗(yàn)找出了熱水提取法在80℃，料液比為1∶15、浸提時(shí)間6h 時(shí)，浸提率最高。在此條件下求得黃花菜多糖含量為2.68%，并求得的苯酚硫酸法測定黃花菜多糖的換算因子為4.2。

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