梁慧慧，陳昕怡，錢江輝，沙先誼（復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室/智能化遞藥教育部及全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海

201203）

近年來(lái)注射劑中不溶性微?？赡芤l(fā)患者嚴(yán)重不良反應(yīng)等問(wèn)題越來(lái)越引起醫(yī)藥工作者關(guān)注，如不溶性微粒造成局部組織缺血、血栓、組織肉芽腫、嚴(yán)重肺功能障礙甚至死亡[1]。然而，目前國(guó)內(nèi)外藥典對(duì)注射劑的不溶性微粒僅僅設(shè)定大于10μm和大于25 μm兩個(gè)質(zhì)控點(diǎn)，而對(duì)于小于10 μm的粒徑，如2.5μm并未嚴(yán)格規(guī)定。目前，全球范圍內(nèi)對(duì)空氣中不溶性微粒的人體危害越來(lái)越重視，國(guó)內(nèi)許多一線城市已建立對(duì)空氣中粒徑為2.5μm的不溶性微粒的監(jiān)測(cè)。因此，注射劑中缺乏控制的小粒徑不溶性微粒是否會(huì)產(chǎn)生臨床用藥不良反應(yīng)，也已成為一個(gè)重要的研究課題。

本研究選擇祛痰藥鹽酸氨溴索注射劑（AHI）[2-3]為模型藥物，考察并比較4個(gè)不同生產(chǎn)廠家的鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的數(shù)量和分布；通過(guò)復(fù)制肢體缺血再灌注（LIR）大鼠小腸腸系膜微循環(huán)模型[4-5]，考察4個(gè)廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒在動(dòng)物水平上對(duì)微循環(huán)功能的影響，旨在為進(jìn)一步提高注射劑的內(nèi)在質(zhì)量與臨床用藥安全性提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BH-2微循環(huán)顯微鏡（日本Olympus公司）；BI-2000圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HANGPING FA-2004電子天平（上海天平儀器廠）；MilliQ純水儀（美國(guó)Millipore公司）；臺(tái)式離心機(jī)（北京市六一儀器廠）；NICOMPTMCW788激光散射粒度儀（美國(guó)Nicomp公司）；X90-3潔凈工作臺(tái)（上海正值凈化科技有限公司，潔凈度：100級(jí)）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸氨溴索對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100599-200502，純度：＞99.6%）；鹽酸氨溴索注射液[A廠（原研廠），國(guó)藥準(zhǔn)字J20140032，批號(hào)：227060（A1）、227086（A2）、128149（A3），規(guī)格：15 mg∶2 ml；B廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041473，批號(hào)：20120202（B1）、20120204（B2）、20130132（B3），規(guī)格：15 mg∶2 ml]；注射用鹽酸氨溴索粉末[C廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H20031344，批 號(hào)：20130327G6（C1）、20130327G10（C2）、20130406T4（C3），規(guī)格：每支30 mg；D廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050243，批號(hào)：12100722（D1）、13022726（D2）、13031428（D3），規(guī)格：每支15 mg]；聚苯乙烯微球標(biāo)準(zhǔn)品（上海啟發(fā)生物科技有限公司，規(guī)格：0.5μm、2.5μm、25μm）；甲醇、乙腈（美國(guó)TEDIA公司，色譜純）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

2 方法

2.1 顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定不溶性微粒[6]

按照2010年版《中國(guó)藥典》（二部）不溶性微粒檢查法中顯微鏡計(jì)數(shù)法的規(guī)定操作，在潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作，分別測(cè)定A、B、C、D廠共12批鹽酸氨溴索注射劑的有效濾過(guò)面積上最長(zhǎng)粒徑大于10 μm和大于25 μm的微粒數(shù)。其中，10 μm以上的微粒不得超過(guò)3 000粒/支，25 μm以上的微粒不得超過(guò)300粒/支。

2.2 光子相關(guān)光度（PCS）法測(cè)定不溶性微粒[7-9]

采用PCS法，用激光散射粒度儀測(cè)定A、B、C、D廠共12批鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的粒徑及分布。測(cè)定參數(shù)為He-Ne激光；測(cè)定角度：90°；溫度：23 ℃；黏度：0.933 cPa；折光系數(shù)：1.333；波長(zhǎng)：632.8 nm。對(duì)于注射液，取1支，將其外壁洗凈，小心開啟，用2ml一次性注射器抽取藥液后立即注入檢測(cè)池中，測(cè)定其粒徑及分布；對(duì)于注射用粉末，先用滅菌注射用水溶解15 min后，再按照注射液的方法測(cè)定。

2.3 不溶性微粒對(duì)大鼠腸系膜微循環(huán)的影響

2.3.1 不溶性微粒混懸液的制備 取鹽酸氨溴索注射液1支，用0.2μm孔徑濾膜濾過(guò)，取濾膜上的殘留物用250μl生理鹽水重新混懸，即得；取注射用鹽酸氨溴索粉末1支，先用生理鹽水制備成7.5 mg/ml的溶液，再吸取2 ml用0.2μm孔徑濾膜濾過(guò)，取濾膜上的殘留物用250μl生理鹽水重新混懸，即得；取3種粒徑的聚苯乙烯微球標(biāo)準(zhǔn)品，用生理鹽水稀釋成50μg/ml的稀釋液，即得。

2.3.2 分組、給藥與取樣 取大鼠于術(shù)前12 h禁食，自由飲水，采用Rosenthal法復(fù)制大鼠LIR模型，用橡皮圈環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部，阻斷血流4 h后松解，恢復(fù)血流灌注2 h后尾iv單次給藥。實(shí)驗(yàn)分為模型組與正常組，每組再分為8小組，每小組10只，各組分別尾iv給予生理鹽水、4個(gè)廠家的鹽酸氨溴索注射劑和粒徑為0.5、2.5、25 μm的聚苯乙烯微球，給藥量為250μl。正常大鼠依次記為CN、CA、CB、CC、CD、CE、CF、CG組，模型大鼠依次記為RN、RA、RB、RC、RD、RE、RF、RG組。給藥20 min后觀測(cè)腸系膜微循環(huán)各項(xiàng)指標(biāo)。

2.3.3 腸系膜微循環(huán)指標(biāo)的觀測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)暴露大鼠距回盲部10 cm處的腸系膜，固定于盛有37 ℃生理鹽水的微循環(huán)灌流盒中，將微循環(huán)顯微鏡與圖像分析系統(tǒng)連接，觀察和記錄各組大鼠腸系膜微循環(huán)變化，測(cè)定微靜脈血流速度（Blood flow velocity of venule，BFVV）、微靜脈管徑（Diameter of venule，DV）。①BFVV的測(cè)定：采用光點(diǎn)同步掃描法測(cè)定BFVV，調(diào)節(jié)光點(diǎn)使之與血管平行并順血流方向連續(xù)掃描，調(diào)節(jié)掃描速度使之與血流速度同步并記錄；②DV的測(cè)量：取血管較直段，與血管縱軸垂直方向測(cè)血管直徑3次，取平均值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 不溶性微粒的顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果

4個(gè)廠家的鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的數(shù)量均符合《中國(guó)藥典》要求，并且廠家間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定4個(gè)廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 不溶性微粒的PCS法測(cè)定結(jié)果

4個(gè)廠家的鹽酸氨溴索注射劑在0.5～50 μm的粒子掃描范圍內(nèi)，其不溶性微粒的平均粒徑和《中國(guó)藥典》規(guī)定的兩個(gè)質(zhì)控粒徑差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但其小粒徑（0.5～2.5 μm）的不溶性微粒數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，鹽酸氨溴索注射液的小粒徑不溶性微粒數(shù)量明顯少于注射用鹽酸氨溴索粉末復(fù)溶15 min后的小粒徑不溶性微粒數(shù)量。PCS法測(cè)定4個(gè)廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結(jié)果見(jiàn)表2，粒徑分布見(jiàn)圖1。

表1 顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定4個(gè)廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結(jié)果Tab 1 Results of insoluble particles of AHI from 4 manufacturers testing by microscope counting method

表2 PCS法測(cè)定4個(gè)廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結(jié)果Tab 2 Results of insoluble particles of AHI from 4 manufacturers testing by PCS

3.3 大鼠的腸系膜微循環(huán)情況

在正常狀態(tài)下，與CN組比較，除CG組外其余各組大鼠BFVV明顯減小，CB、CD、CE、CF組大鼠DV明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中CE、CF、CG組微循環(huán)效果與粒徑大小呈負(fù)相關(guān)。LIR條件下，與RN組比較，其余各組大鼠BFVV明顯減小，RB、RD組大鼠DV明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明在正常狀態(tài)條件下，CA、CB、CC、CD組大鼠的腸系膜微血管均出現(xiàn)了一定程度的微循環(huán)障礙，其中CA組大鼠的微循環(huán)狀態(tài)受影響程度最低，類似于CN組；CE、CF、CG組大鼠的腸系膜受到的微循環(huán)影響與粒徑呈負(fù)相關(guān)，即粒徑越小影響越嚴(yán)重。而在LIR狀態(tài)下，RN組大鼠的腸系膜微血管表現(xiàn)出流速減慢的特征，表明成功復(fù)制了LIR模型；RA、RB、RC、RD組大鼠的腸系膜微循環(huán)均出現(xiàn)明顯的一定程度的微循環(huán)障礙。正常狀態(tài)下和LIR狀態(tài)下各組大鼠的BFVV、DV比較分別見(jiàn)表3、表4。

4 討論

圖1 4廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的粒徑分布圖Fig 1 Distribution of particle size of AHI from 4 manufacturers

表3 正常狀態(tài)下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 3 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in normal condition（，n＝10）

表3 正常狀態(tài)下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 3 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in normal condition（，n＝10）

注：與CN組比較，＊P＜0.01Note：vs.CN group，＊P＜0.01

本文采用PCS法考察了注射劑中不溶性微粒的粒徑及分布。相比于顯微鏡計(jì)數(shù)法，PCS法更能直觀地分析產(chǎn)品中不溶性微粒的分布。4個(gè)廠家的注射劑產(chǎn)品采用PCS法檢測(cè)不溶性微粒的結(jié)果表明，不溶性微粒數(shù)量均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定；在0.5～50 μm的粒子掃描范圍內(nèi)，其不溶性微粒的平均粒徑和《中國(guó)藥典》規(guī)定的兩個(gè)質(zhì)控粒徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但小粒徑的不溶性微粒數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，原研A廠制劑中的不溶性微粒在此范圍內(nèi)的不溶性微粒數(shù)量相對(duì)少于其余3個(gè)廠家的產(chǎn)品。在考察的制劑中，鹽酸氨溴索注射液的小粒徑不溶性微粒數(shù)量明顯少于注射用粉末，分析原因可能是：（1）注射用粉末由于需要加入一定量的甘露醇作為凍干保護(hù)劑，可能會(huì)引入不溶性微粒；另一方面，由于凍干粉末的溶解具有時(shí)間依賴性，未溶解的固體粉末可能也是導(dǎo)致在本研究的復(fù)溶時(shí)間條件下測(cè)定得的小粒徑不溶性微粒偏多的重要原因，如延長(zhǎng)凍干粉末的復(fù)溶時(shí)間，可能在一定程度上會(huì)降低注射用粉末中小粒徑不溶性微粒的數(shù)量。（2）注射用粉末中膠塞在復(fù)溶過(guò)程中也可能導(dǎo)致一定程度的不溶性微粒的產(chǎn)生。（3）制備工藝的差異。

表4 LIR狀態(tài)下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in LIR condition（，n＝10）

表4 LIR狀態(tài)下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in LIR condition（，n＝10）

注：與RN組比較，＊P＜0.01Note：vs.RN group，＊P＜0.01

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)制劑的內(nèi)在質(zhì)量，本文通過(guò)建立微循環(huán)的動(dòng)物模型，考察了4個(gè)廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒對(duì)微循環(huán)功能影響的差異性。研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)廠家的鹽酸氨溴索注射劑組大鼠均出現(xiàn)了一定程度的微循環(huán)障礙，且影響微循環(huán)的程度具有明顯的差異性。其中，原研A廠制劑中不溶微粒的數(shù)量相對(duì)較少，對(duì)微循環(huán)的影響程度也相對(duì)較輕。對(duì)于已有微循環(huán)損傷的機(jī)體（即LIR狀態(tài)），注射劑中的不溶性微粒對(duì)其有更大的損傷。在陽(yáng)性對(duì)照組中，0.5、2.5μm的不溶性微粒在正常狀態(tài)下對(duì)微循環(huán)的影響反而高于25μm的不溶性微粒，這可能主要是由于25μm的不溶性微粒經(jīng)靜脈給藥后大部分微粒被肺循環(huán)濾過(guò)后，減少了不溶性微粒在觀察部位腸系膜微血管的蓄積，從而在一定程度上降低了不溶性微粒對(duì)微循環(huán)功能的影響，而小粒徑微粒反而更易在微血管部位蓄積。已有文獻(xiàn)報(bào)道，0.5μm左右的不溶性微粒與心血管系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性[10]，而注射劑中小粒徑不溶性微粒數(shù)量的差異性是否會(huì)引起臨床用藥過(guò)程中患者的不良反應(yīng)發(fā)生的差異性，以及是否具有劑量依賴性，則需要開展進(jìn)一步的臨床評(píng)價(jià)研究予以確證。

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