喬世琴，孫著葉，李維剛，吳立磊（.日照市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，山東日照 76800；.山東綠因藥業(yè)有限公司，山東臨沂 76000）

帕拉米韋是由美國(guó)生物晶體公司研制的一種環(huán)戊烷神經(jīng)氨酸酶抑制劑，是世界首個(gè)靜脈途徑治療流感的藥物，該藥可有效抑制各種流感病毒株，具有耐受性好、毒性小等優(yōu)點(diǎn)。2010年由日本鹽野義制藥株式會(huì)社推廣上市，用于甲型、乙型流感病毒感染癥的治療[1]。2013年，我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)抗流感新藥帕拉米韋氯化鈉注射液上市，現(xiàn)有臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明該藥對(duì)甲型和乙型流感有效[2]。但目前尚未有帕拉米韋氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的文獻(xiàn)報(bào)道。為確保臨床用藥安全，筆者采用細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠檢查法[3-4]檢測(cè)了帕拉米韋氯化鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

KXB-12A 型恒溫培養(yǎng)箱（上海科析試驗(yàn)儀器廠）；XW-8A型漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；PHS-2F 型雷磁酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；XS 105型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

帕拉米韋氯化鈉注射液（山東綠因藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130901、130902、130903，規(guī)格：60 ml∶300 mg）；鱟試劑[TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1010211，標(biāo)示靈敏度：0.25 EU/ml；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：1007121，標(biāo)示靈敏度：0.125 EU/ml）]；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1010150，規(guī)格：100 EU/ml）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（BET）用水（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1011230，規(guī)格：50 ml/瓶）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，確定大容量注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為0.5 EU/ml。根據(jù)公式L＝K/M計(jì)算。K 為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K＝5 EU/（kg·h）；M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大劑量。帕拉米韋氯化鈉注射液靜脈注射最大用藥劑量為600 mg（120 ml），給藥時(shí)間每次至少為15 min，平均體質(zhì)量按60 kg計(jì)，靜脈注射時(shí)間按1 h計(jì)，故L＝K/M＝2.5 EU/ml。根據(jù)《化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》的要求，為保證用藥安全，本研究規(guī)定帕拉米韋氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.5 EU/ml。

2.2 樣品最小有效稀釋濃度（c）的確定

根據(jù)公式c＝λ/L計(jì)算。式中，L為0.5 EU/ml，λ為TAL 靈敏度。目前，市售TAL的λ為0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03 EU/ml，得c為5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/ml。

2.3 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的方法操作[3]，結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表1[注：“+”表示凝膠形成（陽性）；“－”表示凝膠未形成（陰性）]。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)

取BET用水將帕拉米韋氯化鈉注射液稀釋成質(zhì)量濃度為5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/ml 的系列濃度溶液，作為供試品陰性對(duì)照溶液（NPC）。另制備相同濃度的系列供試品溶液，使每一供試品溶液中含有2.0λ（0.50 EU/ml）的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為陽性對(duì)照溶液（PPC）。另設(shè)CSE的陽性對(duì)照管（PC）和BET用水陰性對(duì)照管（NC）各2管，按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作，結(jié)果見表2（注：“+”表示陽性反應(yīng)；“－”表示陰性反應(yīng)）。

表1 TAL靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab 1 Recheck results of TAL sensitivity test

表2 樣品干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of pre-interference test of samples

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，帕拉米韋氯化鈉注射液原液對(duì)兩批TAL均有強(qiáng)抑制作用，樣品經(jīng)稀釋后，TAL的最大不干擾濃度（2.5 mg/ml）對(duì)試驗(yàn)可能無干擾。

2.5 干擾試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml 的供試品溶液及BET 用水分別稀釋CSE，制成細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 EU/ml 的系列溶液，與兩批TAL 反應(yīng)，按2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果見表3[注：Es為BET用水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值；Es＝lg－1（∑Xs/4），Et＝lg－1（∑Xt/4）；“+”表示陽性反應(yīng)；“－”表示陰性反應(yīng)]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，Es為2～0.5 EU/ml，Es/Et為0.5～2，說明質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml 的樣品溶液對(duì)TAL無干擾，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

表3 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of interference test of samples

取3 批次的樣品各適量，加BET 用水制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml的溶液，使用λ為0.25 EU/ml的TAL，按文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并按要求做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對(duì)照，結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表4（注：“+”表示陽性反應(yīng)；“－”表示陰性反應(yīng)）。

表4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 4 Results of bacterial endotoxin test

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是通過TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素間產(chǎn)生凝聚反應(yīng)以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的一種方法，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[8]。在進(jìn)行預(yù)干擾試驗(yàn)時(shí)，加入BET 用水將帕拉米韋氯化鈉注射液稀釋并溶解到質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml時(shí)不干擾測(cè)定。本試驗(yàn)中筆者采用兩家不同企業(yè)的TAL對(duì)3個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)比[9]，在樣品質(zhì)量濃度稀釋至2.5 mg/ml及以下時(shí)，不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。因此，帕拉米韋氯化鈉注射液用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的。

綜上所述，本方法可用于帕拉米韋氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

[1]陳小勇，李佩杰，梁杰.一種帕拉米韋德制備方法：中國(guó)，201110034757.9[P].2011-02-09.

[2]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.帕拉米韋氯化鈉注射液[EB/OL].（2013-04-05）[2013-08-20].http：//www.sfda.gov.cn/WS01/CL0001/.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄85.

[4]劉海疆，陳志勇，田冰，等.長(zhǎng)春西汀氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（1）：108.

[5]李霞.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥品申報(bào)資料中應(yīng)注意的問題[J].中國(guó)藥事，2007，21（6）：401.

[6]李榮，吳玲.動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素[J].中國(guó)藥房，2012，23（9）：837.

[7]厲青，陳娟紅，陸金花.注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸內(nèi)毒素檢查方法的建立[J].中國(guó)藥房，2013，24（25）：2 376.

[8]周梅，武谷.注射用鹽酸吉西他濱細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究[J].中國(guó)藥房，2013，24（1）：77.

[9]蔣立云，湯群，堵嫻，等.注射用嗎替麥考酚酯的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可行性研究[J].藥物分析雜志，2013，28（3）：490.