董 靜，李三紅，王永慶，戴云志（1.南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院，南京 10008；.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南京 10008；.南京優(yōu)科生物醫(yī)藥有限公司，南京 10009）

注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）是一種新型抗菌藥物復方制劑。原衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網（基礎網）的調查結果顯示[1-3]，頭孢噻肟的耐藥率逐年增高，并且革蘭陰性菌耐藥問題在第三代頭孢菌素類藥物中以頭孢噻肟最為嚴重。頭孢噻肟的主要耐藥機制是細菌產生的β-內酰胺酶對其水解滅活，而他唑巴坦對β-內酰胺酶有抑制作用，二者聯(lián)用可抑制細菌耐藥性、發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。該復方制劑臨床上主要用于產β-內酰胺酶耐藥菌感染的治療。

與其他半合成的β-內酰胺類抗菌藥物一樣，注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）在生產和貯存過程中也會形成頭孢噻肟高分子聚合物，在臨床使用中可能會引發(fā)速發(fā)型過敏反應[4-5]，因此控制其含量非常必要。2010年版《中國藥典》收載了頭孢噻肟鈉中高分子聚合物檢查項，采用的是以葡聚糖凝膠G-10為填充劑的凝膠色譜柱[6]。但近年來，隨著分析技術的不斷發(fā)展，高效分子排阻色譜（HPSEC）法逐漸成熟。該法測定抗菌藥物中高分子雜質時更為準確、靈敏，且操作簡便，因此其應用也越來越廣泛。本試驗建立了使用TSK-GEL G2000SWXL 凝膠色譜柱的HPSEC 法，用于測定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）中高分子聚合物的含量，現(xiàn)報道如下。

1 材料

LC-20A 型高效液相色譜（HPLC 儀），包含真空在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、SPD-20A 檢測器和LCsolution 化學工作站（日本島津公司）；MS205DU 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）（南京優(yōu)科生物醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：1.17 g，批號：20120401、20120402、20120403）；頭孢噻肟、他唑巴坦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130483-200303、130511-200402，純度：90.6%、99.1%）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和磷酸等均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：TSK-GEL G2000SWXL 凝膠色譜柱（30 cm×7.8 mm，5 μm）；流動相：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液[0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉（61∶39，V/V），用0.1 mol/L磷酸調節(jié)pH 至7.0]；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μl；柱溫：25 ℃。

2.2 溶液的制備

頭孢噻肟對照品溶液：取頭孢噻肟對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 ml 中約含頭孢噻肟170 μg的溶液，即得。

他唑巴坦對照品溶液：取他唑巴坦對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含他唑巴坦10 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成每1 ml中約含頭孢噻肟1.0 mg的溶液，即得。

空白溶劑：流動相。

2.3 專屬性考察

分別取空白溶劑、他唑巴坦對照品溶液、頭孢噻肟對照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，主峰相鄰高分子聚合物峰保留時間為9.600 min，其與主峰分離度為3.472；他唑巴坦、空白溶劑及其他雜質均不干擾本品中高分子聚合物的測定。

圖1 高效分子排阻色譜圖A.空白溶劑；B.他唑巴坦對照品；C.頭孢噻肟對照品；D.供試品溶液；1.聚合物-1；2.聚合物-2；3.聚合物-3；4.頭孢噻肟；5.他唑巴坦Fig 1 HPSEC chromatogramsA.blank solvent；B.reference substance of tazobactam；C.reference substance of cefotaxime；D.solution of test sample；1.polymer-1；2.polymer-2；3.polymer-3；4.cefotaxime；5.tazobactam

2.4 線性關系考察

取頭孢噻肟對照品約11 mg，精密稱定，置于100 ml 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置于50 ml 量瓶中，加流動相定容，搖勻。分別精密量取上述溶液1、10、20、40、50、60、80、100 μl注入HPLC儀進樣，記錄色譜。以進樣量（x，ng）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得頭孢噻肟回歸方程y＝2 075x－477.2（r＝0.999 9）。結果表明，頭孢噻肟進樣量在2.3～226.4 ng范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.5 檢測限、定量限考察

取“2.2”項下頭孢噻肟對照品溶液適量，加流動相逐級稀釋后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10 計算頭孢噻肟的定量限為0.45 ng，以信噪比為3計算頭孢噻肟的檢測限為0.14 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2”項下頭孢噻肟對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣5 次，記錄峰面積。結果，頭孢噻肟峰面積的RSD為0.14%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）（批號：20120401）適量（約相當于頭孢噻肟10 mg），精密稱定，置于10 ml 量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，分別于25 ℃下放置0、1、2、3、4、5、6 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結果，高分子聚合物峰面積隨著時間延長而增加，頭孢噻肟峰面積的RSD為12.17%（n＝7），表明供試品溶液不穩(wěn)定，不宜長時間放置，應臨用新配。

2.8 重復性試驗

取注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）（批號：20120401）適量（約相當于頭孢噻肟10 mg），共6份，精密稱定，分別置于10 ml量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣測定高分子聚合物的含量。結果，高分子聚合物平均含量為1.05%，RSD為0.79%（n＝6），表明本方法重復性較好。

2.9 耐用性考察

本試驗分別考察了采用不同柱溫、流速、波長、pH、流動相鹽濃度對注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）（批號：20120401）中高分子聚合物含量測定的影響，結果見表1（注：分離度1指聚合物-1峰與聚合物-2峰之間的分離度；分離度2指聚合物-2峰與聚合物-3峰之間的分離度；分離度3指聚合物-3峰與相鄰主峰之間的分離度）。由表1可知，上述因素在一定范圍內變化對高分子聚合物峰之間以及高分子聚合物峰與主峰之間的分離度影響不大，均符合2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅤD HPLC法的要求，說明本方法的耐用性良好。

表1 耐用性試驗結果Tab 1 Results of durability test

2.10 樣品中聚合物的含量測定

取3 批樣品各適量，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算高分子聚合物含量，并且同采用2010年版《中國藥典》收載的G-10法測定的高分子聚合物的含量進行比較，結果見表2。

表2 樣品中聚合物的含量測定結果（n＝3，%）Tab 2 Results of contents determination of polymer in samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 HPSEC法與G-10法的比較

抗菌藥物中的高分子聚合物系指其中分子量大于藥物本身的雜質的總稱，其分子量一般在1 000～5 000 Da，個別可達10 000 Da左右。由于高分子聚合物具有高度不均一性和不確定性，無法制備出具有固定含量的對照品，現(xiàn)行版《美國藥典》未收載相關測定方法。2010年版《中國藥典》收載的以自身對照外標法定量測定β-內酰胺類抗菌藥物中高分子聚合物的方法，通過兩種流動相的轉換，以藥品自身對照品取代高分子聚合物對照品對其中的高分子聚合物進行檢測，為相關研究指出了一個新的方向。

本試驗曾根據(jù)2010 年版《中國藥典》頭孢噻肟鈉項下規(guī)定，采用以葡聚糖凝膠G-10 為填充劑的凝膠色譜柱對注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）中的高分子聚合物的含量進行測定。結果表明，該色譜柱的柱效低（柱效僅1 000 左右），進樣濃度高（20 mg/ml），峰形拖尾，分析時間長（一個樣品需要2 h 左右），分離效果差（所有高分子聚合物為一個峰，且該峰與主峰未能達到基線分離），導致高分子聚合物的檢出量非常低。而采用以TSK-GEL G2000SWXL為填充劑的凝膠色譜柱進行測定，柱效高（上萬），分析時間短（一個樣品僅需要20 min），分離效果好（高分子聚合物峰與主峰能達到基線分離）。故高分子聚合物的檢出量更高，更適合于測定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）中聚合物的含量。

3.2 流動相的選擇

在酸性和堿性條件下頭孢噻肟均可發(fā)生聚合反應[7]，因此測定時應選擇pH 為中性的流動相系統(tǒng)。本試驗參照2010 年版《中國藥典》中頭孢菌素類抗菌藥物高分子聚合物測定方法，選用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）為流動相，發(fā)現(xiàn)高分子聚合物與樣品能達到基線分離。同時，本試驗還進行了流動相的耐用性試驗，微調磷酸鹽緩沖鹽的濃度，分別用0.009 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和0.011 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）進行考察，發(fā)現(xiàn)微調流動相鹽濃度對分離度和柱效均無明顯影響，說明以0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）為流動相的耐用性良好。因此，最終選擇0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）為流動相。

3.3 測定波長的選擇

注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）中高分子聚合物主要是由頭孢噻肟聚合而成，由于難以獲得高分子聚合物對照品，而高分子聚合物是由單體聚合而成，所以本試驗參考2010年版《中國藥典》頭孢噻肟鈉中高分子聚合物檢查項下的檢測波長，選擇254 nm為測定波長。在此波長下，他唑巴坦及其他雜質均不干擾該復方制劑中高分子聚合物的測定。

3.4 對照品的選擇和準確度的考察

由于頭孢噻肟高分子聚合物是由頭孢噻肟單體分子通過分子間的氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用而形成的，未破壞其分子結構，也未改變其化學性質，頭孢噻肟高分子聚合物和頭孢噻肟單體分子具有相似的色譜行為，因此可以用頭孢噻肟作為對照品，來測定頭孢噻肟高分子聚合物的含量。

由于無法獲得頭孢噻肟高分子聚合物的對照品，因此無法進行加樣回收率試驗，并且本制劑中不含任何輔料，也無需進行回收率試驗。本研究重復性試驗中連續(xù)測定了6 份供試品中高分子聚合物的含量，其RSD為0.79%，說明本方法的重復性較好；另外，通過考察不同柱溫、流速、波長、pH、流動相鹽濃度對供試品中高分子聚合物含量測定的影響，結果表明上述因素在一定范圍內變化對高分子聚合物峰之間以及高分子聚合物峰與主峰之間的分離度影響不大，說明本方法耐用性較好。由此說明本方法測定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）中高分子聚合物的含量的準確度較好。

綜上所述，本方法操作簡單、專屬性強、靈敏度高，可用于注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）中高分子聚合物的含量測定。

[1]劉根焰，童明慶，梅亞寧，等.Mohnarin 2009年度報告：青壯年（14～65歲）來源菌株耐藥監(jiān)測[J].中國臨床藥理學雜志，2011，27（7）：508.

[2]梅亞寧，童明慶.2010 年度衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網報告：青壯年來源菌株耐藥監(jiān)測結果[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2012，22（1）：44.

[3]梅亞寧，童明慶.2011 年度衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網報告：成年患者分離菌的耐藥監(jiān)測[J].中國臨床藥理學雜志，2014，30（2）：94.

[4]金少鴻，胡昌勤.β-內酰胺類抗生素過敏反應研究進展[J].中國新藥雜志，1994，3（4）：38.

[5]霍秀敏.β-內酰胺類抗生素高分子雜質的研究[J].藥品評價，2005，2（5）：324.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：217-218.

[7]胡昌勤，金少鴻，孫學蘭.頭孢菌素結構和其聚合反應關系的探討：Ⅰ.結構對反應類型的影響[J].中國抗生素雜志，1991，16（1）：25.