張艷霞，吳勇杰，李文廣（1.甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心，蘭州 730000；.蘭州大學基礎醫(yī)學院藥理學研究所/甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，蘭州 730000）

蛇葡萄素（Ampelopsin）為存在于葡萄科、楊梅科、杜鵑科、藤黃科、大戟科及柳科等植物中的一種重要的黃酮類化合物[1]。蛇葡萄素鈉（Ampelopsin sodium，AMP-Na）為蛇葡萄素高水溶性鈉鹽，是甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室為了提高蛇葡萄素的溶解性及穩(wěn)定性，使其更適合臨床使用而制備的一種化合物[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄植物具有抑制酪氨酸酶活性[3]、抑制腫瘤細胞增殖的作用[4-7]，引起了國內外學者普遍關注。但是，AMP-Na 與化療藥物卡鉑聯(lián)用對人肺腺癌GLC-82 細胞是否有抑制作用？作用機制是什么？尚未見文獻報道。為此，本研究考察了AMP-Na單用及與卡鉑聯(lián)用對人肺腺癌GLC-82細胞的生長抑制、誘導凋亡作用，以探討其抗腫瘤作用機制。

1 材料

1.1 儀器

Coulter EpicsXL 型流式細胞儀（美國Beckman-Coulter 公司）；IX31 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；2306 型CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；SW-CJ-IFD型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；ELX800 型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Tek 公司）。

1.2 藥品與試劑

AMP-Na注射用無菌粉末（批號：051115，純度：98.8%，規(guī)格：50 mg/支）、AMP-Na 注射用無菌粉末專用稀釋液（批號：051118，pH 6.8，規(guī)格：5 ml/支）均購自廣東泰禾醫(yī)藥科技有限公司；注射用卡鉑無菌粉末（齊魯制藥有限公司，批號：6120152DA，規(guī)格：100 mg/支）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司，批號：050126）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；MTT（美國Fluka公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.3 細胞

人肺腺癌GLC-82 細胞購自中科院上海細胞生物研究所細胞庫。

2 方法

2.1 各組細胞增殖抑制率的檢測

取對數(shù)生長期的GLC-82細胞，調整細胞密度至5×104ml－1，以90 μl/孔加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后加入藥物10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。試驗以3.12、6.25、12.5、25、50 μg/ml 卡鉑，25、50、100 μg/ml AMP-Na，3.12、6.25、12.5、25、50 μg/ml 卡鉑+25、50、100 μg/ml AMP-Na 聯(lián)合作用于GLC-82 細胞，同時設空白對照（僅常規(guī)培養(yǎng)液）組、陰性對照（細胞+培養(yǎng)液）組。于試驗終止前4 h加入MTT（10 μl/孔），試驗終止時加入10% 十二烷基硫酸鈉（SDS，100 μl/孔），置于培養(yǎng)箱中過夜。次日于波長570 nm處測定光密度（OD），按下式計算抑制率。抑制率（IR，%）＝{[（陰性對照組OD－空白對照組OD）－受試藥組OD]/（陰性對照組OD－空白對照組OD）}×100%。每板各質量濃度設3個復孔。

2.2 各組活細胞、凋亡細胞、壞死細胞占比的測定

取對數(shù)生長期的GLC-82 細胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調節(jié)細胞密度至1×105ml－1，以9 ml/瓶接種于10 個培養(yǎng)瓶。試驗分為陰性對照（常規(guī)培養(yǎng)液）組，卡鉑（25 μg/ml）組，AMP-Na①、②、③、④（12.5、25、50、100 μg/ml）組與聯(lián)合用藥①、②、③、④（AMP-Na 12.5、25、50、100 μg/ml+卡鉑25 μg/ml）組。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，分別以1 ml/瓶加入藥物或生理氯化鈉溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，制備樣本，以流式細胞儀檢測分析。公式：細胞占比（%）＝活細胞或凋亡細胞或壞死細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組細胞增殖抑制率的檢測結果

質量濃度在25～100 μg/ml范圍內時，AMP-Na對GLC-82細胞的增殖具有抑制作用，且與質量濃度呈正相關；質量濃度在50～100 μg/ml 范圍內，AMP-Na 對3.12、6.25、12.5、25、50 μg/ml卡鉑抑制GLC-82細胞增殖具有協(xié)同效應。各組細胞增殖抑制率的檢測結果見表1（表中AMP-Na 0 μg/ml+卡鉑0 μg/ml為陰性對照）。

表1 各組細胞增殖抑制率的檢測結果（，n＝3，%）Tab 1 The inhibitory rate of Amp-Na to cell proliferation in each group（，n＝3，%）

表1 各組細胞增殖抑制率的檢測結果（，n＝3，%）Tab 1 The inhibitory rate of Amp-Na to cell proliferation in each group（，n＝3，%）

注：與陰性對照比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與相應質量濃度卡鉑比較，#P＜0.01Note：vs.negative control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the corresponding concentration carboplatin，#P＜0.01

3.2 各組活細胞、凋亡細胞、壞死細胞占比的檢測結果

與陰性對照組比較，卡鉑組，AMP-Na④組與聯(lián)合用藥①、③、④組活細胞占比減少，凋亡細胞占比增加；卡鉑組，AMP-Na③、④組與聯(lián)合用藥①、②、③、④組壞死細胞占比增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。與卡鉑組比較，聯(lián)合用藥①、③、④組活細胞占比減少，凋亡細胞占比增加；聯(lián)合用藥③、④組壞死細胞占比增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01 或P＜0.05）。各組活細胞、凋亡細胞、壞死細胞占比的檢測結果見表2；各組細胞凋亡和壞死變化見圖1。

表2 各組活細胞、凋亡細胞、壞死細胞占比的檢測結果（，n＝4）Tab 2 The proportion of living cell，apoptosis cell and dead cell in each group（，n＝4）

表2 各組活細胞、凋亡細胞、壞死細胞占比的檢測結果（，n＝4）Tab 2 The proportion of living cell，apoptosis cell and dead cell in each group（，n＝4）

注：與陰性對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；卡鉑組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.negative control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.carboplatin group，#P＜0.05，##P＜0.01

4 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌發(fā)病率的80%左右。由于其發(fā)現(xiàn)時往往已屬晚期，喪失了手術機會，且預后較差，故化療是晚期NSCLC的主要治療方法。近半個世紀以來，腫瘤藥物的發(fā)展均集中在細胞毒化療藥物上。雖然在蒽環(huán)類（如阿霉素、表阿霉素）、鉑類（如順鉑、卡鉑）之后又有很多強有力的藥物如紫杉醇、鹽酸伊立替康注射液等相繼問世，但化療藥物單獨使用由于療效低、毒性大，所以并未對進展期NSCLC 的治療及生存期帶來突破性進展。至今對于NSCLC 的治療，仍主張應用聯(lián)合化療，以達到增加療效、提高患者生存期的目的。含鉑方案目前仍是治療晚期NSCLC 的標準方案。以鉑類藥物為基礎的聯(lián)合化療雖能改善晚期非小細胞肺癌患者的生存期、癥狀和生活質量，但其療效已經達到了平臺期[8]，提高療效關鍵在于推出高效低毒的新藥。中藥（有效提取成分[9]、單味藥[10]、復方成分[11]）誘導腫瘤細胞凋亡已成為一條很有希望治療腫瘤的新途徑[12]。本研究結果表明，AMP-Na 25～100 μg/ml與系列質量濃度的卡鉑合用后，對卡鉑抑制GLC-82細胞的增殖有協(xié)同作用。

細胞凋亡的發(fā)生是一個極其復雜的過程，受多種機制調節(jié)和制約。流式細胞Annexin Ⅴ-PI 雙染色法利用Annexin Ⅴ能與凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸特異結合，PI 能特異透過死細胞膜使其染色的原理，可將凋亡早期、晚期細胞以及死細胞區(qū)分開，是目前常用的細胞凋亡檢測方法。本研究用Annexin Ⅴ-PI 雙染法檢測AMP-Na 單用及與卡鉑聯(lián)合作用GLC細胞48 h 后的細胞存活狀態(tài)，結果顯示25～100 μg/ml 的AMP-Na 作用于GLC-82 細胞48 h 后，處于凋亡和壞死狀態(tài)的細胞隨著AMP-Na 質量濃度的增加而增多?？ㄣK25 μg/ml 與AMP-Na 12.5～100 μg/ml聯(lián)合應用后，凋亡和壞死狀態(tài)的細胞比AMP-Na單獨應用時明顯增加。本研究結果表明，AMP-Na可以誘導GLC-82 細胞凋亡并產生細胞毒，進而誘導GLC-82細胞凋亡，且對卡鉑的細胞增殖抑制起到協(xié)同作用，具體機制有待進一步研究。

圖1 各組細胞凋亡和壞死變化（48 h）A.陰性對照組；B.卡鉑組；C.AMP-Na④組；D.AMP-Na③組；E.AMP-Na②組；F.AMP-Na①組；G.聯(lián)合用藥④組；H.聯(lián)合用藥③組；I.聯(lián)合用藥②組；J.聯(lián)合用藥①組Fig 1 The change of cell apoptosis and necrosis in each grou（p48 h）A.negative control group；B.carboplatin group；C.AMP-Na ④group；D.AMP-Na ③group；E.AMP-Na ②group；F.AMP-Na ①group；G.drug combination ④group；H.drug combination ③group；I.drug combination ②group；J.drug combination ①group

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