蘇 瑾，焦 鈞，于 蓮，孫維彤，胡艷秋，郭 宇（佳木斯大學藥學院省高校生物藥制劑重點實驗室，黑龍江佳木斯 154007）

山藥（Dioscoreaceae japonica）為薯蕷科植物薯蕷的干燥根莖，性平、味甘，有健脾除濕、補氣益腎等功效[1-2]。自古以來山藥就是藥食同源的保健食品之一，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)山藥主要含有豐富的淀粉、蛋白質、多糖、脂肪酸、游離氨基酸等營養(yǎng)成分，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫功能等藥理作用，其中多糖為山藥的主要活性成分之一[3-5]。近年來多糖作為降糖活性物質的研究受到了人們的青睞，其對糖尿病及其并發(fā)癥的預防和治療具有藥性平和、不良反應小等特點。文獻顯示目前降糖藥物作用機制多以建立胰島素抵抗的細胞或動物模型進行研究[6-12]。為此，筆者研究山藥多糖對正常HepG2細胞及胰島素抵抗模型HepG2細胞體外降糖作用的影響，為下一步山藥多糖體內降糖活性研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

3100型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；酶標儀（美國Tecan 公司）；A1130232 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；DW-HL388 型超低溫冷凍儲存箱（中科美菱低溫有限責任公司）；LS-C50L 型高壓蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設備有限公司）；TDZ4-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

山藥多糖（陜西慈緣生物技術有限公司，批號：201101207，純度：95%）；胰島素（美國Sigma 公司）；鹽酸二甲雙胍片（河南興源制藥有限公司，批號：1305200，規(guī)格：0.25 g/片）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；葡萄糖試劑盒、胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；青鏈霉素原液（中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德生物有限公司，pH 7.2～7.6）；MTT、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Amresco公司。

1.3 細胞

HepG2細胞（中國科學院細胞生物學研究所）。

2 方法

2.1 山藥多糖對正常細胞的葡萄糖消耗試驗

取對數(shù)生長期的正常HepG2 細胞，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，用10%FBS培養(yǎng)液吹打均勻，在倒置顯微鏡下調整細胞密度至1×104ml－1，每孔200 μl，接種于96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，傾去培養(yǎng)液，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，待細胞適應無血清環(huán)境后再將培養(yǎng)液傾出，更換無血清含藥培養(yǎng)基。將正常HepG2 細胞分為正常對照（常規(guī)培養(yǎng)液）組、二甲雙胍（0.01 mg/ml）組與山藥多糖高、中、低濃度（質量濃度分別為1.00、0.10、0.01 mg/ml）組，每孔100 μl，每組設3 復孔。培養(yǎng)24 h 后，取40 μl 培養(yǎng)液用葡萄糖試劑盒檢測葡萄糖剩余含量，并計算葡萄糖消耗量（ΔGC），考察山藥多糖對正常HepG2細胞ΔGC影響；棄去培養(yǎng)液，加上無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，以不鋪細胞的培養(yǎng)液為空白組。用葡萄糖試劑盒檢測培養(yǎng)液中葡萄糖剩余含量，ΔGC＝空白組細胞葡萄糖含量－用藥組細胞葡萄糖含量。

2.2 山藥多糖對胰島素抵抗細胞的葡萄糖消耗試驗

將處于對數(shù)生長期的正常HepG2 細胞以1×104ml－1的密度接種于96孔板，每孔板200 μl，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。加入含有胰島素的培養(yǎng)液，使胰島素的終濃度為1×10－7mol/L[13]以復制胰島素抵抗模型。將胰島素抵抗細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，用10%FBS培養(yǎng)液吹打均勻，在倒置顯微鏡下調整為細胞密度1×104ml－1的單細胞懸液，每孔200 μl，接種于96 孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，傾去培養(yǎng)液，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，待細胞適應無血清環(huán)境后再將培養(yǎng)液傾出，更換無血清含藥培養(yǎng)液。將胰島素抵抗細胞分為模型（常規(guī)培養(yǎng)液）組、二甲雙胍（0.01 mg/ml）組與山藥多糖高、中、低濃度（質量濃度分別為1.00、0.10、0.01 mg/ml）組，每孔100 μl，每組設3 復孔；另設正常對照（常規(guī)培養(yǎng)液）組。培養(yǎng)24 h后，取40 μl培養(yǎng)液用葡萄糖試劑盒檢測葡萄糖剩余含量，按“2.1”項下方法計算ΔGC，考察山藥多糖對模型細胞ΔGC的影響。

2.3 細胞形態(tài)學觀察

將“2.2”項下各組細胞，置倒顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，并拍照記錄。

2.4 MTT試驗

取“2.1”和“2.2”項下各組細胞培養(yǎng)液，分別加入20 μl MTT 溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h 后，傾去上清液，加入200 μl DMSO，振蕩10 min 至紫色結晶溶解，用酶標儀于490 nm 波長下檢測各孔的光密度（OD）。OD水平代表細胞存活水平，以ΔGC/OD表示單位細胞ΔGC。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 正常HepG2細胞的ΔGC檢測結果

與正常對照組比較，二甲雙胍組與山藥多糖高、中、低濃度組正常細胞ΔGC 增加，ΔGC/OD 增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；山藥多糖高、中濃度組正常細胞OD 減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，山藥多糖可使單位細胞的ΔGC增加。各組正常HepG2細胞ΔGC的檢測結果見表1。

表1 各組正常HepG2細胞的ΔGC檢測結果（，n＝3）Tab 1 Glucose consumption of normal HepG2 cells in each group（，n＝3）

表1 各組正常HepG2細胞的ΔGC檢測結果（，n＝3）Tab 1 Glucose consumption of normal HepG2 cells in each group（，n＝3）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01

3.2 胰島素抵抗HepG2細胞的ΔGC檢測結果

與正常對照組比較，模型組細胞ΔGC 減少，ΔGC/OD 降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組與山藥多糖高、中、低濃度組細胞ΔGC增加，ΔGC/OD升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；山藥多糖高、中濃度組細胞OD減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。結果表明，山藥多糖可使單位胰島素抵抗HepG2細胞ΔGC增加。各組胰島素抵抗HepG2細胞的ΔGC檢測結果見表2。

表2 各組胰島素抵抗HepG2 細胞的ΔGC 檢測結果（，n＝3）Tab 2 Glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells in each group（，n＝3）

表2 各組胰島素抵抗HepG2 細胞的ΔGC 檢測結果（，n＝3）Tab 2 Glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells in each group（，n＝3）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 正常HepG2細胞與胰島素抵抗HepG2細胞的形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察，正常HepG2 和胰島素抵抗HepG2 細胞均貼壁生長，細胞呈梭形、菱形、不規(guī)則形；兩組細胞生長狀態(tài)均未見明顯差別。正常HepG2細胞與胰島素抵抗HepG2細胞的形態(tài)見圖1。

圖1 正常HepG2細胞與胰島素抵抗HepG2細胞的形態(tài)A1.正常HepG2細胞（×200）；A2.正常HepG2細胞（×400）；B1.胰島素抵抗HepG2細胞（×200）；B2.胰島素抵抗HepG2細胞（×400）Fig 1 Cytomorphology photos of normal HepG2 cells and Insulin-resistant HepG2 cellsA1.normal HepG2 cells（×200）；A2.normal HepG2 cells（×400）；B1.Insulin-resistant HepG2 cells（×200）；B2.Insulin-resistant HepG2 cells（×400）

4 討論

HepG2 細胞來源于人肝胚胎瘤細胞株，其是一種表型與正常肝細胞極為相似的肝癌細胞，并且保留了正常肝細胞的特征和功能。2 型糖尿病主要是外周組織對胰島素不夠敏感（胰島素抵抗）造成血液中葡萄糖升高，因此采用HepG2 細胞胰島素抵抗模型來研究2型糖尿病是合適的。

研究結果證實山藥多糖不僅可以增加正常HepG2 細胞ΔGC，也能很好地增加胰島素抵抗HepG2細胞ΔGC，且呈劑量依賴性。MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，MTT數(shù)值高低代表細胞數(shù)的多寡[14-15]。MTT試驗中，0.10、1.00 mg/ml質量濃度下，山藥多糖對HepG2細胞增殖有明顯抑制作用，說明用正常HepG2及胰島素抵抗HepG2單位細胞ΔGC（即ΔGC/OD）可以扣除細胞增殖的影響。本研究提示增強HepG2細胞對胰島素的敏感性可能是山藥多糖防治2 型糖尿病的作用機制之一，但山藥多糖降糖作用機制有待于進一步研究。

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