張麗軍，姚亞敏，賈小芳，尹 林，劉曉茜，沈銀忠，盧洪洲，程能能（.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 20508；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 200032）

目前艾滋?。ˋIDS）的治療方法主要為抗病毒治療[1]。然而，發(fā)展中國家的患者由于經(jīng)濟問題或其他臨床癥狀，常用中草藥進行輔助甚至替代治療[2-5]。根據(jù)一份來自烏干達（Uganda）的報道：63.5%的人類獲得性免疫病毒（HIV）陽性患者使用過中草藥，同時使用抗病毒藥物和中草藥者占32.8%。在中國，唐草片是唯一一個被國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準用于HIV 感染者的藥物[6]，正被越來越多的患者所使用。當唐草片與抗病毒藥物同時使用時，唐草片能清除氧自由基[7]，用于HIV 感染者以及AIDS 患者（CD4 淋巴細胞在100～400個/mm3之間），有提高CD4淋巴細胞計數(shù)的作用，可改善乏力、脫發(fā)、食欲減退和腹瀉等癥狀，改善活動功能狀況。然而唐草片成分非常復(fù)雜，其對抗病毒藥物的影響令人擔憂。為了降低潛在的藥物-藥物相互作用，藥廠建議服用抗病毒藥物60 min 后服唐草片。本課題組也通過臨床試驗驗證了兩者服用相隔60 min后唐草片不會影響抗病毒藥物血藥濃度的結(jié)論[8]。但如果兩藥同時服用將極大地方便患者，提高患者的服藥依從性。為此，本研究在大鼠模型中研究唐草片與依非韋倫（EFV）同時服用時，唐草片對EFV藥動學(xué)的影響，以為臨床用藥提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；API-3200型質(zhì)譜儀（美國Biosystems公司）。

1.2 藥品與試劑

EFV對照品（美國USP公司，批號：1234103，純度：99.8%，規(guī)格：200 mg/瓶）；替米沙坦（內(nèi)標，北京柏雅方舟醫(yī)藥科技有限公司，批號：040511，純度：99.5%，規(guī)格：500 mg/瓶）；EFV片（美國Merck 公司，批號：S2520，規(guī)格：600 mg/片）；唐草片（上海百歲行藥業(yè)有限公司，批號：090301，規(guī)格：400 mg/片）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為Millipore 超純水。

1.3 動物

2 方法與結(jié)果[9-12]

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），預(yù)柱C18（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液-甲醇（20∶80，V/V），流速：0.5 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧氣壓：35 psi；霧化器溫度：550 ℃；氣流速度：10 L/min；掃描時間為10 min。用于定量反應(yīng)的離子對分別為內(nèi)標替米沙坦：m/z515.2→276.2，EFV：m/z316.0→243.9。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取EFV對照品9.60 mg，用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，制備成EFV質(zhì)量濃度分別為750、1 500、3 000、6 000、12 000、24 000、48 000、96 000 ng/ml的對照品系列溶液，4 ℃貯藏，備用。

2.3.2 內(nèi)標溶液的制備 精密稱取替米沙坦10.85 mg，用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，制備成質(zhì)量濃度為1.080 mg/ml的內(nèi)標溶液，用50%甲醇稀釋制備內(nèi)標工作液質(zhì)量濃度為100 ng/ml，4 ℃貯藏，備用。

2.3.3 質(zhì)控樣品的制備 分別取不同質(zhì)量濃度的對照品系列溶液10 μl 與100 ng/ml 內(nèi)標溶液10 μl，加入100 μl 空白血漿中，制得質(zhì)量濃度為1 500、3 000、7 680 ng/ml質(zhì)控樣品（即高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品），－80 ℃貯藏，備用。

2.4 血漿樣品的處理

精密吸取大鼠血漿樣品100 μl，置于1.5 ml 離心管中，加入50%甲醇10μl、100 ng/ml內(nèi)標溶液10 μl、1 ml乙酸乙酯，渦旋混合5 min，以13 400×g離心10 min，吸取上清液（乙酸乙酯層）至另一1.5 ml 離心管中；下層溶液用1 ml 乙酸乙酯按上述方法再提取1 次，上清液合并至相應(yīng)離心管中，37 ℃氮氣吹干，殘渣用100 μl 流動相復(fù)溶，渦流混合，取上清液10 μl進樣。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法專屬性 分別取EFV 對照品、內(nèi)標、空白血漿、空白血漿+EFV對照品（24 000 ng/ml）、給藥后60 min大鼠血漿，按“2.4”項下方法處理樣品后，按“2.1”“2.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)以及EFV 的可能代謝產(chǎn)物不干擾EFV 和內(nèi)標的測定。質(zhì)譜見圖1；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜見圖2。

圖1 質(zhì)譜圖A.內(nèi)標；B.EFV對照品Fig 1 The mass spectrometry profilesA.internal standard；B.EFV control

圖2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+EFV對照品；C.給藥60 min后大鼠血漿；1.內(nèi)標；2.EFVFig 2 LC-MS/MSA.blank plasma；B.blank plasma+EFV control；C.plasma 60 min after administration；1.internal standard；2.EFV

2.5.2 標準曲線的制備 按“2.3”項下方法制備對照品溶液，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定。以EFV質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、峰面積積分值和內(nèi)標峰峰面積之比（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝1.79×10－5x+2.12×10－5（r＝0.993 2）。結(jié)果表明，EFV 質(zhì)量濃度在75.0～9 600 ng/ml 范圍內(nèi)與峰面積積分值和內(nèi)標峰峰面積之比呈良好線性關(guān)系。

2.5.3 準確度與精密度試驗 按“2.3”項下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5 份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下色譜、質(zhì)譜條件考察日內(nèi)精密度（5次）、日間精密度（3 d）、準確度（5次）。結(jié)果，3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品日內(nèi)、日間RSD＜10%，準確度在92.1%～102.0%之間，表明該試驗方法符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則中的有關(guān)規(guī)定。精密度與準確度試驗結(jié)果見表1。

表1 精密度與準確度試驗結(jié)果Tab 1 Results of precision test and accuraly

2.5.4 提取回收率試驗 按“2.3”項下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5 份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定。測得峰面積后與同質(zhì)量濃度對照品溶液直接進樣所得峰面積進行比較，計算提取回收率。結(jié)果顯示，高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品有著一致的回收率。提取回收率試驗結(jié)果見表2。

表2 提取回收率試驗結(jié)果（n＝5，%）Tab 2 Results of the extraction recovery test（n＝5，%）

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各6 份，置于4 ℃保存24 h 后測定，考察血漿樣品的短期穩(wěn)定性；取“2.3”項下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各6份，冷凍貯藏于－80 ℃，30 d 后測定，考察血漿樣品的長期穩(wěn)定性；取“2.3”項下高、中、低質(zhì)量濃度的標準質(zhì)控樣品各6 份，冷凍貯藏于－80 ℃，在室溫中充分解凍，然后再次冷凍，每次間隔24 h，重復(fù)3個凍融周期后測定，考察血漿樣品的3個周期的凍融穩(wěn)定性。結(jié)果，被測物在上述保存條件下測得實際值均在理論值的85%～115%范圍波動，RSD＜10.0%，表明EFV 在血漿樣品中穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（，n＝6，%）Tab 3 Results of stability Test（，n＝6，%）

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（，n＝6，%）Tab 3 Results of stability Test（，n＝6，%）

2.5.6 基質(zhì)效應(yīng) 取6份不同來源的大鼠空白血漿100 μl，經(jīng)液-液萃取處理后，加入內(nèi)標和不同質(zhì)量濃度的混合溶液，制得高、中、低質(zhì)量濃度的血漿樣品（質(zhì)量濃度與“2.3.3”項下相同），內(nèi)標終質(zhì)量濃度為10 ng/ml；另取流動相100 μl代替空白血漿，按“2.3”項下方法處理。按“2.1”“2.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定，將測得的相應(yīng)峰面積相比評價基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果，比值均在93.1%～101.2%之間，RSD＜15%，表明大鼠血漿生物基質(zhì)不影響樣品測定。

2.6 藥動學(xué)研究

18 只SD 大鼠隨機均分為3 組，分別單獨ig 給予EFV（54 mg/kg，即EFV 組）、同時ig 給予EFV 和唐草片（54 mg/kg+864 mg/kg，即EFV-0T 組）、ig 給予EFV60 min 后ig 給予唐草片（54 mg/kg +864 mg/kg，即EFV-60T 組）。用藥劑量按照人體（以60 kg計）與大鼠的每1 kg體質(zhì)量劑量折算系數(shù)6.25進行計算，EFV臨床用藥劑量為600 mg/次、唐草片為3 200 mg/次，tid；此外適當考慮大鼠的給藥體積，最后確定EFV 和唐草片的用藥劑量分別為54、864 mg/kg。于大鼠ig 給藥前與末次給藥后0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、9.0、12.0、24.0 h 頸動脈取血，測定不同時間血藥濃度，用DAS 2.0 軟件分析計算藥動學(xué)參數(shù)。采用SPSS 16.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以表示；多組間比較先用單因素分析其正態(tài)分布，后以雙向獨立變量樣品檢測（Two-independent-samples tests）中的Mann-WhitneyU法進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

與EFV組相比，EFV-0T組大鼠體內(nèi)EFV的血藥濃度上升緩慢，但是EFV-60T組的EFV血藥濃度-時間的曲線與EFV組基本一致。與EFV 組相比，EFV-0T 組EFV 的AUC0-∞和t1/2降低了近1 倍，MRT0-∞降低，CL/F明顯提高。但是EFV-60T 組EFV 的藥動學(xué)參數(shù)與EFV 組一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在各組大鼠的tmax、cmax、V/F差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。EFV 血藥濃度-時間曲線見圖3；EFV 藥動學(xué)參數(shù)見表4。

圖3 EFV血藥濃度-時間曲線Fig 3 Plasma concentration-time curve of EFV

表4 EFV藥動學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of EFV（，n＝6）

表4 EFV藥動學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of EFV（，n＝6）

注：與EFV組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.EFV group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

AIDS 患者有各種并發(fā)癥，中藥有利于患者的治療[13]。但是中草藥含有多種活性成分，且通常作用機制不明，使得中草藥-西藥的相互作用在所難免，可能會給患者帶來危險[14-15]。為了降低唐草片對抗病毒藥物的影響，臨床上推薦服用抗病毒藥物60 min 后服用唐草片。這種服用間隔給患者工作、生活帶來不便，影響患者的依從性。因此，本研究在大鼠模型中比較同時ig給予EFV和唐草片或者ig給予EFV 60 min后再ig給予唐草片對大鼠體內(nèi)EFV 血藥濃度的影響。通過LC-MS/MS測定各組大鼠中EFV的血藥濃度，發(fā)現(xiàn)EFV和唐草片同時服用明顯降低了EFV 的血藥濃度，因此建議至少要在服用EFV 60 min后再服用唐草片。

本研究首次在大鼠模型中比較研究不同的唐草片服藥時間對EFV藥動學(xué)參數(shù)的影響，但其具體機制仍需深入研究。

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