林明寶，白金葉，丁亞思，莊媛媛，侯 琦（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

化學(xué)療法是當前臨床上治療腫瘤的主要手段之一，然而，其所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，尤其是外周血中白細胞明顯減少等機體免疫功能低下，對人體的正常組織器官及機體功能會產(chǎn)生巨大的損害?！端貑枴ぴu熱病論》指出：“邪氣所湊，其氣必虛”，腫瘤是因虛而發(fā)病，化療則更加重患者氣血損耗[1]。近年來，中醫(yī)藥在腫瘤的臨床治療中取得了較大的發(fā)展，其腫瘤治療療效雖不及放、化療，但其以機體整體理論為指導(dǎo)，從調(diào)整機體免疫功能、控制癌癥發(fā)展、延長生存期等方面進行整體綜合治療而凸顯特色與優(yōu)勢。

海參是我國傳統(tǒng)補益中藥，《中醫(yī)大辭典》記載海參具有“補腎益精，養(yǎng)血潤燥”之功效，《本草綱目拾遺》還記載其具有“生百脈血，治休息痢”之功效。海參含有多種生物活性物質(zhì)，如海參多糖、海參皂苷、多肽、各種氨基酸、海參神經(jīng)節(jié)苷酯、活性肽、糖蛋白及活性鈣等[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，海參藥理活性十分廣泛，具有抗凝血、抗血栓、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及促進纖維蛋白溶解等作用。其中，海參的免疫調(diào)節(jié)活性越來越受到關(guān)注。研究報道表明，海參酸性黏多糖可明顯改善荷瘤或免疫功能低下小鼠的細胞免疫抑制狀態(tài)，提高巨噬細胞吞噬功能[3]。為此，本研究旨在探討海參提取物對化療藥物環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的影響，為發(fā)現(xiàn)海參免疫調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)及開發(fā)新型藥物提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

PowerWave XS2 型酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；生物安全柜（美國ESCO 公司）；3K15型離心機（美國Sigma 公司）；IC1000型細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物有限公司）；BS224S 型分析天平（美國Sartorius 公司）；COINC型倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

海參提取物[由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所方起程教授提供，含量：1.36 g（生藥）/ml]；環(huán)磷酰胺（批號：C0768，含量：97%～103%）、鹽酸左旋咪唑（批號：31742，含量：99.7%）、脂多糖（LPS，批號：L2630，含量：10 mg/100 μl）、刀豆蛋白A（ConA，批號：C5275，含量：1 mg/ml）、MTT（批號：M2128）均購自美國Sigma公司；1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（北京鈕因華信科技有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；小鼠免疫球蛋白（Ig）G酶聯(lián)免疫印跡（ELISA）測試盒（南京森貝伽生物科技有限司）；2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）溶液（北京鈕因華信科技有限公司）。

1.3 動物

2 方法

2.1 復(fù)制模型與分組、給藥

50 只ICR 小鼠隨機均分為正常對照（等容生理氯化鈉溶液）組、模型（等容生理氯化鈉溶液）組、左旋咪唑（40 mg/kg，相當于臨床用藥劑量的10 倍）組與海參提取物高、低劑量[500、250 mg（生藥）/kg，相當于海參臨床用藥劑量的20、10倍]組，灌胃（ig）給藥，每天1次，連續(xù)10 d。給藥7 d后，腹腔注射（ip）環(huán)磷酰胺（40 mg/kg），每天1次，連續(xù)3 d以復(fù)制小鼠免疫功能低下模型[4]。

2.2 檢測指標

2.2.1 各組小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的檢測 小鼠末次給藥1 h后，眼眶后靜脈采血20 μl，立即放入2 ml蒸餾水中，作為對照管。采血后，小鼠尾靜脈注射（iv）0.5%剛果紅溶液（0.1 ml/10 g），分別于iv 30 s與5 min后，眼眶后靜脈采血20 μl，放入2 ml 蒸餾水使溶血作為樣品管。于分光光度計510 nm 波長處測定樣品管和對照管的光密度（OD），計算吞噬指數(shù)（κ）、吞噬系數(shù)（即校正吞噬指數(shù)，α）：κ＝（lgODt1－lgODt2）/（t2－t1）；α＝體質(zhì)量/肝脾合質(zhì)量；吞噬能力增強率（%）＝（給藥組α－模型組α）/模型組α×100%。式中，t2＝5 min，t1＝30 s。

2.2.2 各組小鼠外周血白細胞數(shù)的檢測 末次給藥1 h后，小鼠眼眶靜脈采血，肝素抗凝，白細胞計數(shù)液溶血，細胞計數(shù)儀讀取白細胞數(shù)。

2.2.3 各組小鼠血清IgG 含量的檢測 末次給藥1 h 后，小鼠眼眶靜脈采血，以離心半徑為6.5 cm、3 000 r/min離心20 min，取血清。參照小鼠IgG的ELISA試劑盒說明書操作，于酶標儀450 nm處測定OD，并繪制標準曲線，計算小鼠血清IgG含量。

2.2.4 各組小鼠免疫臟器指數(shù)的計算 末次給藥1 h 后處死小鼠，剖取胸腺、脾臟，用電子分析天平稱其濕質(zhì)量，分別計算臟器指數(shù)（臟器質(zhì)量/體質(zhì)量）。

2.2.5 各組小鼠脾淋巴細胞增殖率的檢測 末次給藥1 h 后處死小鼠，無菌取出脾臟，剪碎，用針栓研磨，以預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液沖洗，過單細胞網(wǎng)篩，制備脾單細胞懸液，調(diào)整至適宜細胞密度，接種于96 孔板中，5×105/孔，每組設(shè)3 個復(fù)孔；除正常對照組給予等體積溶劑外，其余各組分別加入LPS 終質(zhì)量濃度10 μg/ml 或ConA 終質(zhì)量濃度5 μg/ml，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h；于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入CCK-8 溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，振蕩混勻，于酶標儀450 nm處測定OD，計算淋巴細胞增殖率（%）。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組小鼠κ、α差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，左旋咪唑組與海參提取物高劑量組小鼠κ升高，左旋咪唑組與海參提取物高、低劑量組小鼠α升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。左旋咪唑組與海參提取物高、低劑量組小鼠單核巨噬細胞吞噬能力增強率分別為22.78%、25.46%、43.33%。各組小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的檢測結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 1 Results of phagocytic ability of mononuclear macrophage of mice in each group（，n＝10）

表1 各組小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 1 Results of phagocytic ability of mononuclear macrophage of mice in each group（，n＝10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.model group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.2 各組小鼠外周血白細胞數(shù)的檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組小鼠外周血白細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，左旋咪唑組與海參提取物高劑量組小鼠外周血白細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。各組小鼠外周血白細胞數(shù)的檢測結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠外周血白細胞數(shù)的檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 2 Results of the number of peripheral blood leukocytes of mice in each group（，n＝10）

表2 各組小鼠外周血白細胞數(shù)的檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 2 Results of the number of peripheral blood leukocytes of mice in each group（，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 各組小鼠血清IgG含量的檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組小鼠血清IgG 含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，左旋咪唑組與海參提取物高、低劑量組小鼠血清IgG 含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。各組小鼠血清IgG 含量的檢測結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠血清IgG含量的檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 3 Results of the level of serum IgG of mice in each group（，n＝10）

表3 各組小鼠血清IgG含量的檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 3 Results of the level of serum IgG of mice in each group（，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.4 各組小鼠免疫臟器指數(shù)的計算結(jié)果

與正常對照組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，左旋咪唑組與海參提取物高、低劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組小鼠免疫臟器指數(shù)的計算結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠免疫臟器指數(shù)的計算結(jié)果（，n＝10）Tab 4 Results of the index of immune organs of mice in each group（，n＝10）

表4 各組小鼠免疫臟器指數(shù)的計算結(jié)果（，n＝10）Tab 4 Results of the index of immune organs of mice in each group（，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01

3.5 各組小鼠脾淋巴細胞增殖率的檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組小鼠LPS 刺激增殖率、ConA刺激增殖率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，左旋咪唑組與海參提取物高、低劑量組小鼠LPS刺激增殖率、ConA刺激增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組小鼠脾淋巴細胞增殖率的檢測結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠脾淋巴細胞增殖率的檢測結(jié)果（，n＝3）Tab 5 Results of the proliferation of spleen lymphocytes of mice in each group（，n＝3）

表5 各組小鼠脾淋巴細胞增殖率的檢測結(jié)果（，n＝3）Tab 5 Results of the proliferation of spleen lymphocytes of mice in each group（，n＝3）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01

4 討論

免疫系統(tǒng)損傷是臨床化學(xué)療法常見的毒副作用之一，易導(dǎo)致機體免疫功能缺陷或下降，引起骨髓抑制，主要表現(xiàn)為機體白細胞和血小板下降等；白細胞的減少在一定程度上也削弱了患者的免疫力[5-6]。本研究采用烷化劑氮芥的衍生物環(huán)磷酰胺作為模型藥物，構(gòu)建化療藥物致小鼠免疫功能低下模型。研究結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺可明顯降低小鼠外周血白細胞數(shù)，而海參提取物可明顯增加模型小鼠白細胞數(shù)，提示海參提取物具有改善環(huán)磷酰胺所致白細胞數(shù)減少的作用。

巨噬細胞是誘發(fā)細胞免疫應(yīng)答的先決條件，參與機體固有免疫和適用性免疫，其吞噬功能狀態(tài)直接影響免疫應(yīng)答的強弱程度[7]。本研究結(jié)果顯示，海參提取物能明顯提高模型小鼠巨噬細胞吞噬能力。

血清IgG是一組具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)和免疫功能的球蛋白，主要存在于體液內(nèi)和淋巴細胞表面，是機體抗體的物質(zhì)基礎(chǔ)。IgG是抗菌、抗病毒、抗腫瘤等的主要免疫球蛋白，約占總量的70%～75%。IgG 較其他免疫球蛋白更易擴散到血管外間隙，在結(jié)合補體、增強免疫細胞吞噬功能等方面發(fā)揮著重要作用[8]。因此，血清IgG 含量是檢測體液免疫功能的重要指標。本研究結(jié)果顯示，化療藥物環(huán)磷酰胺明顯降低了小鼠血清IgG 含量，降低機制免疫能力，而海參提取物則可明顯增加模型小鼠血清IgG含量。

此外，本研究結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺可明顯降低小鼠胸腺和脾臟器官指數(shù)，抑制T、B淋巴細胞的增殖反應(yīng)，而海參提取物對其具有一定的改善趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，海參提取物對化療藥物環(huán)磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下具有一定的調(diào)節(jié)改善作用，與其調(diào)節(jié)化療藥物所致的白細胞數(shù)下降、增強巨噬細胞吞噬功能以及提高血清IgG 含量有關(guān)。本研究結(jié)果為海參調(diào)節(jié)免疫功能的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，并為其免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)研究提供了基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

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[2]黃日明，王賓，劉永宏.海參的化學(xué)成分及其生物活性的研究概況[J].中成藥，2009，16（8）：1 263.

[3]聶衛(wèi)，王士賢.海參的藥理作用及臨床研究進展[J].天津藥學(xué)，2002，14（1）：12.

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[5]張鑫.雷公藤制劑毒副作用及減毒方法研究進展[J].中國藥學(xué)雜志，2013，48（22）：1 897.

[6]李冬云，于婷婷，白樺，等.復(fù)方浙貝顆粒減輕難治性白血病化療后骨髓抑制的臨床研究[J].中國中藥雜志，2012，37（20）：3 155.

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