趙麗穎，宋殿榮（1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦科，天津 300150）

雙黃連凍干粉由金銀花、黃芩、連翹三味藥材提取精煉而成，具有清熱解毒、疏風解表之功效，是目前臨床治療呼吸道感染性疾病的首選藥物之一[1]，也可被用于妊娠期多種感染性疾病的治療[2]。宋殿榮等[3-4]對雙黃連凍干粉透過不同孕期妊娠大鼠胎盤屏障的藥物成分進行了分析，然而，由于種屬差異，動物實驗結果難以直接外推到人類。2013年宋殿榮等[5]又利用胎盤組織薄片培養(yǎng)技術與尤斯擴散池（Ussing chamber）相結合建立了人胎盤屏障體外模型，該模型具備在體胎盤的內(nèi)分泌和物質(zhì)轉運功能，能有效避免種屬差異，模擬在體環(huán)境。而應用該技術的關鍵是建立胎盤灌流液中中藥成分的分析方法。為此，在本研究中筆者建立了采用高效液相色譜（HPLC）法測定胎盤灌流液中雙黃連凍干粉中8種成分含量的方法，為中藥透過胎盤屏障藥物成分研究提供分析方法學借鑒。

1 材料

1260 型HPLC 儀，包括四元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）等；數(shù)控系列超聲處理器FS-150N（上海生析超聲儀器有限公司）。

雙黃連凍干粉（哈藥集團中藥二廠，批號：Z10960058，規(guī)格：600 mg/支）；綠原酸（批號：110753）、連翹酯苷B（批號：111811）、連翹酯苷A（批號：111810）、黃芩苷（批號：110715）、連翹苷（批號：110821）、木犀草素（批號：111520）、漢黃芩苷（批號：P0641）、黃芩素（批號：111595）、葛根素（批號：110752）等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（純度均＞98%）；甲醇（美國Fisher 試劑公司）、乙腈（美國Fisher 試劑公司）、甲酸（美國ROE試劑公司）均為色譜法，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素對照品各適量，加入乙腈溶解并定容至同一10 ml棕色量瓶中，搖勻，配成混合對照品溶液，于4 ℃保存，備用。

2.1.2 內(nèi)標溶液 精密稱取內(nèi)標物葛根素10 mg，置于10 ml量瓶中，加入乙腈稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為1 mg/ml 的標準液，于4 ℃保存，備用。臨用前用乙腈稀釋至質(zhì)量濃度為10 μg/ml的內(nèi)標溶液。

2.1.3 胎盤灌流液 精密稱取NaCl 6.923 g、KCl 0.354 g、NaHCO32.1 g、Na2HPO40.136 g、MgSO4·7H2O 0.288 g、CaCl2·6H2O 0.56 g、葡萄糖（GS）1.8 g、L-丙氨酸0.178 g，混合后以800 ml 雙蒸水充分溶解，調(diào)節(jié)pH 至7.4，雙蒸水補足體積至1 000 ml，用Stericup過濾器濾過，于4 ℃保存，備用。

2.1.4 供試品溶液 精密稱取雙黃連凍干粉適量至10 ml 量瓶中，加入胎盤灌流液定容，超聲（功率：80 W，頻率：20 kHz）溶解，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序詳見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.3 樣品處理方法及測定

取“2.1.4”項下供試品溶液95 μl，置于1.5 ml 聚丙烯管中，加入乙腈5 μl，混勻后加入“2.1.2”項下內(nèi)標溶液200 μl，渦旋30 s，以半徑為3 cm、14 000 r/min 離心10 min，吸取上清液10 μl，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取上述胎盤灌流液、胎盤灌流液加內(nèi)標溶液、胎盤灌流液加混合對照品溶液加內(nèi)標溶液、胎盤灌流液加混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，綠原酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、木犀草素、漢黃芩苷及黃芩素的色譜峰與其左右的干擾峰分離度均大于1.5，各色譜峰的保留時間分別為7.299、10.896、11.728、30.800、18.638、19.336、22.029、22.667、28.955 min，理論板數(shù)均大于4 000。胎盤灌流液對雙黃連凍干粉中8 種成分和內(nèi)標溶液的測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.胎盤灌流液；B.胎盤灌流液加內(nèi)標溶液；C.胎盤灌流液加混合對照品溶液；D.胎盤灌流液加混合對照品溶液加內(nèi)標溶液；E.供試品溶液；E1.圖E在0～18 min放大圖；E2.圖E在19～33 min放大圖；1.綠原酸；2.連翹酯苷B；3.連翹酯苷A；4.黃芩苷；5.連翹苷；6.木犀草素；7.漢黃芩苷；8.黃芩素；9.葛根素Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank placental perfusate；B.blank placental perfusate and internal standard；C.blank placental perfusate and mixed reference substances；D.blank placental perfusate，mixed reference substances and internal standard；E.test sample；E1.the amplified chromatogram in 0-18 min；E2.the amplified chromatogram in 19-33 min；1.chlorogenic acid；2.forsythiaside B；3.forsythiaside A；4.baicalin；5.forsythia glycosides；6.luteolin；7.wogonoside；8.baicalein；9.puerarin

2.4.2 線性關系考察 取1.5 ml離心管8個，分別加入“2.1.3”項下胎盤灌流液95 μl，再分別加入“2.1.1”項下的混合對照品溶液5 μl，混勻后加入“2.1.2”項下內(nèi)標溶液200 μl，使得胎盤灌流液中綠原酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10、20、30、40 μg/ml；黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5、10、15、20 μg/ml，渦旋30 s，以半徑為3 cm、14 000 r/min 離心10 min，吸取上清液10 μl，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、各對照品和內(nèi)標溶液的峰面積比值（y）為縱坐標進行線性回歸，以信噪比為10計算8種成分的定量檢測限（LOQ），結果見表2。

表2 線性關系試驗結果Tab 2 Results of linear range

2.4.3 精密度試驗 取“2.1.4”項下供試品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定日內(nèi)精密度；另連續(xù)測定6 d，每天進樣1 次，測定日間精密度，結果見表3。由表3 可見，各成分的RSD均≤1.9，表明精密度良好。

表3 精密度試驗結果（，n＝6）Tab 3 Results of precision tests（，n＝6）

表3 精密度試驗結果（，n＝6）Tab 3 Results of precision tests（，n＝6）

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 以胎盤灌流液為基質(zhì)，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液（批號：Z10960058），分別考察樣品于室溫下放置24 h、－20 ℃冷凍保存7 d 的長期穩(wěn)定性和反復凍融3次的穩(wěn)定性，結果見表4。由表4可見，各成分的RSD≤7.3%，表明供試品溶液穩(wěn)定性較好。

表4 穩(wěn)定性試驗結果（，n＝6）Tab 4 Results of stability tests（，n＝6）

表4 穩(wěn)定性試驗結果（，n＝6）Tab 4 Results of stability tests（，n＝6）

2.4.5 重復性試驗 取雙黃連凍干粉（批號：Z10960058）6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μl，按“2.2”項下色譜條件進樣。結果，RSD 在1.2%～1.9%之間，表明該方法重復性較好。

2.4.6 基質(zhì)效應和回收率試驗 以胎盤灌流液為基質(zhì)，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液共6 份，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，得雙黃連凍干粉中各成分峰面積為A1；另取胎盤灌流液適量，加入適量“2.1.1”項下混合對照品溶液，配制成與雙黃連供試品溶液濃度相同的溶液，每個濃度6份，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，得到雙黃連凍干粉中各成分峰面積為A2；另取去離子水代替胎盤灌流液，加入適量“2.1.1”項下混合對照品溶液，配制成與雙黃連供試品溶液濃度相同的溶液，每個濃度6份，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，得到雙黃連凍干粉中各成分峰面積為A3；以A1/A2 計算回收率，A2/A3 計算基質(zhì)效應，結果見表5。

3 討論

胎盤灌流液中中藥成分的測定是完成中藥離體胎盤透過性研究的基礎。郭潔等[6]曾建立了雙黃連凍干粉HPLC指紋圖譜，但未對胎盤灌流液中藥物成分進行分析。本研究首次建立了測定胎盤灌流液中雙黃連凍干粉中各成分的方法，可為中藥透過胎盤屏障藥物成分研究提供分析方法學借鑒。

為了獲得較好的分離度和峰形，在色譜條件的探索中，筆者嘗試在流動相中添加0.1%甲酸，提高了雙黃連凍干粉中各成分和內(nèi)標物的離子化效率和靈敏度；與等度洗脫相比，選擇了能夠使基質(zhì)效應最小化，且能夠使峰形最優(yōu)化的梯度洗脫，最終實現(xiàn)了雙黃連凍干粉中8 種成分和內(nèi)標物的快速分析檢測。

表5 基質(zhì)效應和回收率試驗結果（n＝6）Tab 5 Results of matrix effects and recovery tests（n＝6）

在樣品前處理方法的優(yōu)化中，本研究采用了更快捷的蛋白沉淀法。由于胎盤灌流液為特殊生物基質(zhì)，其功能是在體外模擬妊娠期母體和胎兒的血液，使胎盤保持活性[7]，因此其成分復雜多樣，尤其是鹽及蛋白含量較高，若在樣品預處理過程中對多余成分去除不完全，易損傷或堵塞色譜柱。國外文獻報道多將胎盤灌流液樣品經(jīng)不同試劑多次蛋白沉淀后，高速離心取上清液進樣[8]，這種方法處理過程較為復雜，且多次沉淀降低了樣品濃度，增加了檢測難度。本研究選用乙腈為蛋白沉淀劑對胎盤灌流液樣品進行前處理，操作簡便、快速、回收率高，可避免使用超濾膜或固相萃取柱帶來的高成本以及液-液萃取的低效率和低提取率。

綜上所述，該方法快速、靈敏，專屬性強，可用于同時測定胎盤灌流液中雙黃連凍干粉中8種成分的含量。

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