胡太德，陳紹成，譚 君（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 40111；.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067）

獨(dú)活始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，擅治下半身風(fēng)濕痹證，中醫(yī)臨床常與羌活配對(duì)聯(lián)用。歷代本草對(duì)其植物來源諸說不一，因其產(chǎn)地不同，差異較大[1-2]。我國藥典收載的獨(dú)活正品為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescensMaxim.的干燥根，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛的功效，臨床多用于風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛，少陰伏風(fēng)頭痛的治療[3]。有研究報(bào)道，獨(dú)活具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板等作用[2，4-7]，其中抗腫瘤的主要成分為蛇床子素、補(bǔ)骨脂素、傘形花內(nèi)脂和異歐前胡素等[6]。2010版《中國藥典》（一部）以蛇床子素和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯為其指標(biāo)性成分對(duì)其進(jìn)行定性定量控制[3]。

作為我國獨(dú)活主產(chǎn)區(qū)重慶，近年來大力調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，在市政府的支持下，巫溪縣和巫山縣政府把獨(dú)活作為當(dāng)?shù)刂饕?jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)來發(fā)展，該地區(qū)以片區(qū)種植為主，正逐步向中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）規(guī)范化種植邁進(jìn)。為配合政府部門加快推進(jìn)區(qū)域內(nèi)道地中藥獨(dú)活產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)當(dāng)?shù)鬲?dú)活的質(zhì)量作分析評(píng)價(jià)很有必要。

近年來，已有學(xué)者對(duì)獨(dú)活在不同生長環(huán)境和不同采收時(shí)期等因素下主要藥效活性成分的含量變化進(jìn)行了研究，并結(jié)合指紋圖譜進(jìn)行了分析[8-10]。然而，目前對(duì)于重慶市道地藥材獨(dú)活不同主產(chǎn)區(qū)（巫山縣和巫溪縣）與全國其他產(chǎn)區(qū)獨(dú)活主要藥效活性成分對(duì)比研究尚未見報(bào)道。本課題組連續(xù)3 年（2012－2014年）于不同月份收集重慶巫溪縣和巫山縣獨(dú)活各9 批，其他地區(qū)獨(dú)活7 批，采用高效液相色譜（HPLC）法，結(jié)合2010 年版《中國藥典》（一部）收載標(biāo)準(zhǔn)，測定其主要藥效活性成分蛇床子素和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯的含量，對(duì)比分析重慶巫山縣、巫溪縣主產(chǎn)區(qū)和國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū)間獨(dú)活中上述兩種成分含量差異，綜合評(píng)價(jià)分析重慶道地藥材獨(dú)活的質(zhì)量，以為重慶產(chǎn)獨(dú)活的品質(zhì)評(píng)價(jià)、種質(zhì)資源保護(hù)和GAP 規(guī)范化種植提供技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括二級(jí)管陣列檢測器（美國Waters公司）；AE200 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)：06-2010）、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯對(duì)照品（批號(hào)：06-2011）均購自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，純度均＞98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

本研究收集來自各地的獨(dú)活（見表1），樣品經(jīng)重慶第二師范學(xué)院陳曉麟教授鑒定為真品，標(biāo)本保存于重慶第二師范學(xué)院；樣品粉碎，過三號(hào)篩，抽真空貯藏，備用。

表1 獨(dú)活來源Tab 1 Origin of A.pubescens

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Shiseido Capcell Pak C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，20%→28%A；5～10 min，28%→36%A；10～13 min，36%→41%A；13～20 min，41%A；20～23 min，41%→75%A；23～30 min，75%→95%A；30～35 min，95%A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)均不低于5 000，分離度大于1.5，詳見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取蛇床子素、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯對(duì)照品各適量，加甲醇制成每1 ml 含蛇床子素75.40μg和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯83.60μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.巫山縣獨(dú)活；C.巫溪縣獨(dú)活；D.甘肅省獨(dú)活Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.A.pubescens in Wushan county；C.A.pubescens in Wuxi county；D.A.pubescens in Ganshu province

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密稱取蛇床子素和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯對(duì)照品7.54、8.36 mg，置于25 ml具塞瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成含蛇床子素0.301 6 mg/ml、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯0.334 4 mg/ml 的混合對(duì)照品貯備液。分別精密吸取不同體積上述對(duì)照品貯備液，以甲醇倍比稀釋制成不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蛇床子素、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯回歸方程分別為y＝3.02×107x+11 030.78（r＝0.999 9）、y＝1.84×107x+12 150.96（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，蛇床子素、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.015 1～0.301 6、0.016 7～0.334 4 mg/ml。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯峰面積的RSD 分別為0.16%、0.57%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：WX-1）適量，分別于放置0、2、4、12、24、48 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯峰面積的RSD 分別為1.18%、1.23%（n＝6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（編號(hào)：WX-1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯峰面積的RSD 分別為1.15 %、1.16%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已含量的樣品（編號(hào)：WX-1）適量，共6份，分別加入高、中、低質(zhì)量的蛇床子素、二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地獨(dú)活各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本研究結(jié)果表明，該方法操作簡便、重復(fù)性好，可用于獨(dú)活中蛇床子素和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯含量的測定。重慶巫山縣和巫溪縣獨(dú)活中主要藥效活性成分（蛇床子素和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯）的含量均高于2010 版《中國藥典》（一部）規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)（蛇床子素不得少于0.50%；二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯不得少于0.08%），初步認(rèn)為重慶巫山縣和巫溪縣產(chǎn)區(qū)獨(dú)特的地理?xiàng)l件與優(yōu)越的生態(tài)環(huán)境適于獨(dú)活的種植。

對(duì)比分析重慶巫山縣、巫溪縣和國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū)獨(dú)活中二者藥效成分含量發(fā)現(xiàn)，重慶巫山縣產(chǎn)區(qū)獨(dú)活中蛇床子素和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯的含量明顯優(yōu)于巫溪縣和國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū)；巫溪縣和國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū)中部分獨(dú)活有效成分含量未達(dá)到2010 版《中國藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn)，需要對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行進(jìn)一步控制。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地間獨(dú)活的化學(xué)成分存在一定差異性，這可能與不同產(chǎn)地間地理?xiàng)l件與生態(tài)環(huán)境差異較大有關(guān)，需對(duì)其作進(jìn)一步研究。本研究為重慶道地藥材獨(dú)活的品質(zhì)評(píng)價(jià)、種質(zhì)資源保護(hù)和推動(dòng)當(dāng)?shù)鬲?dú)活GAP 種植規(guī)范化提供了一定科學(xué)參考依據(jù)。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of sample（n＝3）

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