張正鋒，石 克（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121；2.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121）

現(xiàn)代中藥生產(chǎn)過程中常用的滅菌方法有濕熱、超濾、微波、60Co輻照滅菌法等。其中，60Co輻照滅菌法由于方便、高效等特點(diǎn)而逐步得到關(guān)注和重視，大量用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品的最終滅菌。衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)于1997 年發(fā)布了《60Co 輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)（內(nèi)部試行）》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，丸劑輻照劑量不得大于5 kGy，并列出了可輻照和不可輻照的部分中藥材和中成藥品種，為60Co輻照滅菌的應(yīng)用提供了依據(jù)。藿膽丸為該標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定可輻照的中成藥。近年來大量研究表明，輻照劑量過大，對(duì)某些藥品的某些成分可能會(huì)造成影響甚至破壞[1-2]。由于中藥是多組分協(xié)同作用發(fā)揮藥效，一種或幾種成分的改變，將可能影響藥品安全、有效。有眾多文獻(xiàn)報(bào)道了60Co輻照滅菌對(duì)中藥成分的影響[3-8]，但大多只針對(duì)個(gè)別典型成分進(jìn)行考察，由于中藥成分的復(fù)雜性，通過個(gè)別成分的考察很難說明問題。有研究曾嘗試用高效液相色譜指紋圖譜技術(shù)分析中藥提取物輻照滅菌前后成分變化[9]，但結(jié)果不理想。而目前對(duì)輻照前后中藥中多個(gè)揮發(fā)性組分同時(shí)評(píng)價(jià)的方法，筆者還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，對(duì)藿膽丸中百秋李醇等多個(gè)揮發(fā)性組分的含量變化進(jìn)行分析，以判定不同劑量60Co輻照對(duì)藿膽丸中百秋李醇等揮發(fā)性成分的含量的影響，為藿膽丸60Co輻照滅菌的可行性及其輻照劑量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890型氣相色譜儀（GC），包括7000型質(zhì)譜（MS）檢測(cè)器、Mass hunter 工作站（美國(guó)Agilent 公司）；MSU224S-100-DU 型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

藿膽丸（廣州市藥品檢驗(yàn)所，批號(hào)：130401、130402、130403）；百秋李醇對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110772-200404，純度＞98%）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的處理

取樣品粉末100 g，分別置0、3、6、8、10、25 kGy60Co 輻照劑量下照射，得到經(jīng)過不同劑量單次輻照的樣品（依次編號(hào)為1、2、3、4、5、6）。取經(jīng)過3、6、8、10 kGy60Co輻照劑量照射的樣品粉末50 g，再分別置10 kGy60Co 輻照劑量下照射，得到經(jīng)過重復(fù)輻照處理的樣品（依次編號(hào)為7、8、9、10）。

2.2 試驗(yàn)條件

2.2.1 GC 條件 色譜柱：HP-5MS；程序升溫（初始溫度120 ℃，保持2 min；以4 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；再以8 ℃/min升至250 ℃，保持3 min）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流進(jìn)樣，分流比：50∶1；檢測(cè)器：三重四級(jí)桿MS 檢測(cè)器；載氣：氦氣；流速：1.2 ml/min；進(jìn)樣量：1μl。

2.2.2 MS條件 離子源：電子轟出；轟擊能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描范圍：50～500 amu；MS1四級(jí)桿溫度：150 ℃，MS2四級(jí)桿溫度：150 ℃。在上述試驗(yàn)條件下，各成分基線分離良好，詳見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取百秋李醇對(duì)照品約10 mg，置于10 ml量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，搖勻，即得。

圖1 氣相色譜-質(zhì)譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.β-百秋李烯；2.α-愈創(chuàng)木烯；3.塞舌爾烯；4.α-百秋李烯；5.α-布藜烯；6.5，11-愈創(chuàng)木二烯；7.百秋李醇；8.未鑒定物Fig 1 GC-MS chromatogramsA.reference substance；B.test samples；C.negative control；1.β-patchoulene；2.α-guaiene；3.seychellene；4.α-patchoulene；5.α-bulnesene；6.5，11-guaiadiene；7.patchouli alcohol；8.no identification

2.3.2 供試品溶液 取樣品細(xì)粉約2 g，精密稱定，置于250 ml圓底燒瓶中，加水適量，連接揮發(fā)油測(cè)定器，測(cè)定器上端加水使刻度充滿，再加乙酸乙酯2 ml，連接回流冷凝管，緩緩加熱至沸騰，并保持微沸2 h，放冷，分取乙酸乙酯液。用少量乙酸乙酯洗滌揮發(fā)油提取器，合并乙酸乙酯液，并迅速以盛有少量無水硫酸鈉的漏斗濾過，濾液置于10 ml 量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液 按藿膽丸的處方和制備工藝制備缺廣藿香葉的陰性對(duì)照品，再按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取百秋李醇對(duì)照品20.62 mg，置于10 ml 量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，得質(zhì)量濃度為2.062 0 mg/ml的對(duì)照品溶液，倍比稀釋成質(zhì)量濃度為1.031、0.414 2、0.206 2、0.103 1 mg/ml的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各1 μl，按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以百秋李醇進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝3.687 6×106x+5.163 0（r＝0.999 4，n＝5）。結(jié)果表明，百秋李醇檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.103 1～2.062 0μg。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，百秋李醇峰面積的RSD為0.3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：130401，編號(hào)：1）適量，分別于放置0、4、8、12、18、24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，百秋李醇峰面積的RSD 為0.7%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：130401，編號(hào)：1）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，百秋李醇峰面積的RSD為0.6%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：130401，編號(hào)：1）適量，共9 份，分別加入高、中、低質(zhì)量的百秋李醇對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定[10]

取30 批次樣品各適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)樣品的MS全掃描圖，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，用標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，選取樣品中相對(duì)含量（以測(cè)定物與百秋李醇峰面積之比）≥1%且相似度≥90%的8個(gè)成分進(jìn)行鑒定（其中8號(hào)峰相對(duì)含量較高但譜庫(kù)中沒有檢索到相似度高的化合物信息，且未見文獻(xiàn)報(bào)道，故暫未對(duì)其進(jìn)行鑒定），并計(jì)算百秋李醇含量和其他7 個(gè)化合物的相對(duì)含量，結(jié)果見表2、表3。

表2 百秋李醇含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of the contents determination of patchouli alcohol（n＝3，mg/g）

表3 其余化合物的相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，批號(hào)：130401）Tab 3 Results of the relative contents determination of compounds（n＝3，batch number：130401）

由表2、表3 可知，3 個(gè)批號(hào)的霍膽丸樣品經(jīng)不同劑量60Co輻照后百秋李醇含量不隨輻照劑量的增加而發(fā)生明顯變化。未經(jīng)輻照的樣品與經(jīng)過不同劑量輻照的樣品色譜圖進(jìn)行比較，其中部分成分含量有極小的差異，可能因?yàn)楹刻突虿僮髡`差導(dǎo)致。批號(hào)為130402、130403 的樣品與批號(hào)為130401的樣品上述7 個(gè)化合物相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果變化趨勢(shì)相差不大。由此可見，輻照劑量對(duì)霍膽丸中易揮發(fā)組分影響不大。

3 討論

筆者曾參考2010年版《中國(guó)藥典》（一部）廣藿香藥材的含量測(cè)定方法[11]，用三氯甲烷超聲處理。該方法操作煩瑣，所得提取液顏色很深，且含較多不易揮發(fā)的組分，對(duì)GC-MS系統(tǒng)污染較大。本試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾提取，所得供試液顏色較淺，提取的成分雖不及三氯甲烷超聲提取的多，但均為易揮發(fā)的組分，不易污染色譜系統(tǒng)。

輻照作為一種簡(jiǎn)單高效的滅菌技術(shù)，已大量應(yīng)用于食品加工行業(yè)，其優(yōu)勢(shì)是不用加熱，可對(duì)含熱不穩(wěn)定組分和揮發(fā)性組分較多的樣品進(jìn)行滅菌，在中藥材貯藏和中藥制劑的生產(chǎn)中也應(yīng)用較多。但是輻照可能對(duì)中藥中有效成分產(chǎn)生影響，因此應(yīng)將輻照滅菌效果和導(dǎo)致藥物成分改變這兩個(gè)因素進(jìn)行綜合考慮，以確定最佳輻照劑量。本試驗(yàn)雖證實(shí)輻照劑量對(duì)霍膽丸中易揮發(fā)組分影響不大，但也不宜對(duì)霍膽丸的生產(chǎn)采取無控制的輻照滅菌，應(yīng)該參照食品輻照劑量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，在綜合考慮滅菌效果的同時(shí)，盡量降低輻照劑量。

綜上所述，藿膽丸可采取60Co輻照滅菌，但應(yīng)控制輻照劑量。該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于藿膽丸中揮發(fā)性成分含量的測(cè)定。

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