羅 遠(yuǎn)，葉 雲(yún)，岳桂華，梁健欽，4（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 50011；.解放軍第0醫(yī)院，南寧 5001；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科技處，南寧 50001；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 50001）

芪七連膠囊是廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院開發(fā)的院內(nèi)制劑（原臨床方劑為益氣活血方），由黃芪、黃連、黃柏、三七等7味中藥組成，具有益氣活血、清熱解毒的功效[1-2]，適用于由高血壓引起的眩暈、頭痛、胸悶、心悸、煩躁等癥的治療[3-4]。其原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有黃芪和三七的定性鑒別[5]。為了對(duì)其進(jìn)行深入的開發(fā)，本研究參照《藥品注冊(cè)管理辦法》六類新藥的有關(guān)要求，建立了芪七連膠囊中黃芪、黃柏、黃連的薄層色譜（TLC）鑒別方法和人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的高效液相色譜（HPLC）含量測(cè)定方法，為制定芪七連膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括二級(jí)管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；B3200S-T 型超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司）；AG285型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ZF-20C型自動(dòng)紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

芪七連膠囊（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院民族醫(yī)藥研發(fā)基地，批號(hào)：2013062101、2013062102、2013062103，規(guī)格：0.3 g/粒）；黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201314，純度＞98%）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212，純度＞98%）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201128，純度＞98%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-201223，純度＞98%）、三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)：110745-201318，純度＞98%）、黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)：120974-201311）、黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)：121510-201105）、黃連對(duì)照藥材（批號(hào)：120913-201310）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪 取本品內(nèi)容物2 g，研細(xì)，加甲醇50 ml，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml 使溶解，用水飽和正丁醇提取2 次（每次20 ml）；合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌2 次（每次20 ml）；再以正丁醇飽和的水洗至中性，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，即得供試品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml 含1 mg 的對(duì)照品溶液。另取黃芪對(duì)照藥材2 g按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按處方及制備工藝制備缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法（2010版《中國(guó)藥典》（一部）附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-丙酮-水（13∶5∶7∶2∶1，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見圖1A。

圖1 薄層色譜圖A.黃芪[1～3.供試品（批號(hào)：2013062101、2013062102、2013062103）；4.對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照；6.對(duì)照品]；B.黃柏、黃連[1～3.供試品（批號(hào)：2013062101、2013062102、2013062103）；4.黃柏對(duì)照藥材；5.黃連對(duì)照藥材；6.缺黃柏的陰性對(duì)照；7.缺黃連的陰性對(duì)照；8.對(duì)照品）]Fig 1 TLC chromatogramsA.Astragali Radix[1-3.test samples（batch number：2013062101，2013062102，2013062103）；4.reference crud herb；5.negative control；6.reference substance）]；B.Phellodendri chinensis and Coptidis rhizom[1-3.test samples（batch number：2013062101，2013062102，201306 2103）；4.reference crube herb of Phellodendri Chinensis Cortex；5.reference crube herb of Coptidis Rhizoma；6.negative control without P.chinensis；7.negative control without C.rhizom；8.reference substance）]

2.1.2 黃柏、黃連 取本品內(nèi)容物1 g，研細(xì)，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，即得供試品溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的對(duì)照品溶液。另分別取黃柏、黃連對(duì)照藥材各0.5 g，按供試品溶液制備方法分別制成對(duì)照藥材溶液。再分別制備缺黃柏、黃連的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制成陰性對(duì)照溶液。按TLC 法（2010 版《中國(guó)藥典》（一部）附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶4.5∶1.5∶0.5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見圖1B。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，20%→42%A；30～36 min，20%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：20 ℃。在上述色譜條件下，理論板數(shù)均大于6 000，分離度均大于1.7，各成分基線分離良好，詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Rb1；3.三七皂苷R1Fig 2 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.ginsenosides Rg1；2.ginsenosides Rb1；3.notoginsenosides R1

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1分別為0.45、0.45、0.15 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水飽和的正丁醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液25 m1，置于分液漏斗中，加氨試液洗滌2 次（15、10 ml），取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至5 ml 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方及制備工藝制備缺三七的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μl）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1回歸方程 分 別 為y＝308.915 885x+4.461 478 6（r＝0.999 8）、y＝152.225 275x+38.671 429（r＝0.999 6）、y＝211.146 52x+7.014 285 7（r＝0.999 5，n＝6）。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.9～9.0、0.94～9.4、0.3～3.0 μg。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面積的RSD分別為2.83%、1.20%、0.89%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：2013062101）適量，分別于放置0、1、2、3、5、12、24、48 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面積的RSD分別為1.78%、0.70%、1.46%（n＝8），表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：2013062101）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面積的RSD分別為1.12%、0.60%、1.15%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：2013062101）適量，共6 份，分別加一定質(zhì)量的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

芪七連膠囊中的黃連、黃柏共同含有小檗堿、藥根堿等成分[6-7]，以常用的TLC 法鑒別可見，陰性對(duì)照品在紫外光燈（365 nm）下有相同的斑點(diǎn)，且兩味藥相互干擾。筆者參照2010 版《中國(guó)藥典》（一部）收載的青娥丸項(xiàng)下黃連和黃柏的TLC 法[8]，同時(shí)使用黃柏、黃連對(duì)照藥材以及鹽酸小檗堿作對(duì)照，可以進(jìn)行有效鑒別。

芪七連膠囊中三七作為臣藥，具有活血止血、祛瘀生新、消腫定痛之功效，在本方劑中是益氣活血的主要成分[9-10]。因此，筆者采用HPLC測(cè)定制劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1三七皂苷R1作為質(zhì)量控制指標(biāo)。在供試品的制備中，筆者曾比較了以甲醇和水飽和的正丁醇作為提取液制備供試品。結(jié)果，以甲醇作提取液時(shí)干擾較大，而以水飽和的正丁醇超聲提取，最后以氨試液洗滌，能有效地去除干擾。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于芪七連膠囊的質(zhì)量控制。

[1]岳桂華，卓少元.益氣活血解毒方對(duì)幼齡自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮功能的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（8）：154.

[2]張志偉，岳桂華.益氣活血解毒方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能保護(hù)作用的研究[J].中國(guó)藥房，2012，23（3）：200.

[3]覃裕旺，朱志華，張愛(ài)珍，等.芪七連膠囊對(duì)高血壓病及相關(guān)危險(xiǎn)因素的影響[J].河南中醫(yī)，2013，33（9）：1 463.

[4]覃裕旺，朱志華，張愛(ài)珍，等.芪七連膠囊對(duì)高血壓病患者生存質(zhì)量的影響[J].江蘇中醫(yī)藥，2013，45（4）：25

[5]陳壯，岳桂華，黃敏，等.芪七連膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2013，24（27）：2 551.

[6]況曉，馮年平，張永太，等.大孔吸附樹脂分離純化黃連黃柏總生物堿的工藝研究[J].中成藥，2010，32（3）：396.

[7]劉冬敏，劉樹民，祖金祥，等.黃連解毒湯及其不同配伍組方成分溶出變化研究[J].中成藥，2012，34（1）：74.

[8]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2010 年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：798.

[9]岳桂華，莫蘭，羅遠(yuǎn).益氣活血解毒方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠炎性因子、血管性假血友病因子水平的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2010，19（8）：1 365.

[10]岳桂華，秦小慧.高血壓病“毒”的物質(zhì)基礎(chǔ)[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（2）：133.