張亞茹，羅李王，楊最素，趙玉勤，余方苗，王 飛，丁國芳（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院/浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022）

?？⊿ea anemone）又稱海菊花，是腔腸動(dòng)物門珊瑚蟲綱?？康囊环N較原始的動(dòng)物，共有6科37種，廣泛分布于溫?zé)釒ШＳ?，主要吸附在巖石或沉積物中[1]。其具有滋陰壯陽、收斂止瀉、祛濕殺蟲等多種作用[2]，早在20世紀(jì)70年代就有學(xué)者對其進(jìn)行研究。?？|手內(nèi)含有的可溶性細(xì)胞蛋白和多肽類化合物，具有神經(jīng)和細(xì)胞毒性[3]。且研究還發(fā)現(xiàn)海葵中具有抗腫瘤活性物質(zhì)，對腫瘤細(xì)胞具有殺傷和誘導(dǎo)凋亡的作用[4-6]。舟山黃?？ˋnthopleura xanthograrnmica，下稱“黃海葵”）屬于?？苽?cè)花海葵屬。據(jù)已有研究報(bào)道，其體內(nèi)和觸手中含有強(qiáng)心作用的興奮性肽類毒素和強(qiáng)殺蟲活性的多肽，是海洋抗腫瘤藥物研發(fā)的理想對象[7-8]。

近年來，肺癌的發(fā)病率及病死率呈快速增長，患者就診時(shí)往往已是晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，而化療的毒副作用會(huì)影響患者治療效果和生活質(zhì)量。從海洋生物中提取低毒高效的抗腫瘤活性物質(zhì)是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一，但有關(guān)黃?？鼓[瘤作用的研究尚未見報(bào)道。故筆者通過對黃?？M(jìn)行反復(fù)凍融、丙酮分級(jí)沉淀等方法提取得到黃海葵粗提物，并作用于人肺癌SPC-A1細(xì)胞，研究其體外抗SPC-A1細(xì)胞的活性，以期為黃?？目鼓[瘤生物活性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CF16RX Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；ZHJH-C12090 型超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）；680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；CKX4型倒置顯微鏡、BX41 型熒光顯微鏡、CCD-NC6051 型顯微攝像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：140809）；1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)：1256837）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F4056201，效價(jià)：80 萬u/0.48 g）；鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：140816，效價(jià)：100 萬u/g）；胰蛋白酶（美國Sigma 公司，批號(hào)：1G003907，效價(jià)：42 362 U/g）；MTT（美國Sigma公司，批號(hào)BS0328，純度＞98%）；吖啶橙（AO，批號(hào)：75168-11-5，純度：≥95%）、溴化乙錠（EB，批號(hào)：1239-45-8，純度：≥95%）購自杭州昊天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞與動(dòng)物

人肺癌SPC-A1細(xì)胞購置于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，本實(shí)驗(yàn)所用為第5 代細(xì)胞。舟山黃?？?，從浙江舟山嵊泗海域采集，經(jīng)浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定為真品。

2 方法

2.1 黃?？痔嵛锏闹苽?/h3>

將黃海葵在25 ℃的通風(fēng)環(huán)境中給以干凈的海水飼喂12 h，備用。取飼養(yǎng)后的活黃?？诩兯星逑?，去除其表面雜質(zhì)。取500 g 黃?？跓校惨?00 ml 純水，置于－20 ℃冰柜中冷凍過夜。次日取出室溫下自然解凍，待全部融化后，再置于－20 ℃冰柜中冷凍，重復(fù)凍融3次。最后，以紗布包裹全部融化的黃?？麡悠愤M(jìn)行粗過濾，棄去黃?？w等雜質(zhì)，取其濾液。濾液在4 ℃、14 000 r/min（離心半徑為5.9 cm，下同）條件下離心10 min，收集上清液，即得黃?？痔嵋?。

采用丙酮分級(jí)沉淀法對黃?？痔嵋哼M(jìn)一步提取。在黃?？痔嵋褐蟹謩e加入－20 ℃預(yù)冷過的20%、50%、80%丙酮進(jìn)行分級(jí)沉淀，用玻璃棒攪拌使之迅速沉積。每一步所得的沉淀物在4 ℃、14 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀，冷凍干燥后即得黃海葵粗提物（得率為67%），于－20 ℃保存，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SPC-A1 細(xì)胞在含鏈霉素、青霉素、10%胎牛血清的1640營養(yǎng)液中培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，待長滿培養(yǎng)基80%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞增殖抑制率的檢測

采用MTT法。取SPC-A1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行計(jì)數(shù)并稀釋成細(xì)胞密度為1×104ml－1的細(xì)胞液，接種至96孔板，每孔200 μl。常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h 后吸棄營養(yǎng)液，將SPC-A1 細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組（只加入1640 營養(yǎng)液）和藥物組，藥物組是在1640 營養(yǎng)液中分別加入質(zhì)量濃度分別為0.625、1.25、2.5 mg/ml的黃海葵粗提物，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24、48、72 h后，吸棄營養(yǎng)液，每孔加入含有10%MTT的磷酸鹽緩沖液（PBS）200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄孔中液體，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μl，充分振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀測定各孔490 nm 波長處的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)（IR），IR（%）＝（空白對照組A－藥物組A）/空白對照組A×100%，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)

在6 孔板中放入經(jīng)泡酸、消毒處理后的蓋玻片，以1×105ml－1的細(xì)胞密度將SPC-A1 細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)，24 h 后棄去培養(yǎng)液，分組及給藥同“2.3”項(xiàng)下方法。培養(yǎng)48 h 后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取出蓋玻片，PBS 洗；95%乙醇固定20 min，PBS 洗；蘇木素染色5 min，自來水浸洗使細(xì)胞核藍(lán)化，伊紅復(fù)染30 s；乙醇（50%、75%、95%、100%）依次梯度脫水后使用二甲苯透明2 次，然后中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 AO/EB 熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞接種與實(shí)驗(yàn)分組同“2.4”項(xiàng)下方法。實(shí)驗(yàn)24 h后取出蓋玻片，PBS洗2～3次，進(jìn)行AO/EB染色（AO/EB的配制方法參考試劑操作說明書）。于載玻片上在觀察前滴加PBS 40 μl和AO/EB混合液10 μl，擦凈蓋玻片上殘留的PBS，朝下放置有細(xì)胞的一面，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（即t檢驗(yàn)）。計(jì)量資料以表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖抑制率的檢測結(jié)果

黃?？痔嵛飳PC-A1細(xì)胞的增殖抑制率見表1。

表1 黃?？痔嵛飳PC-A1細(xì)胞的增殖抑制率（，n＝3）Tab 1 Inhibitory rate of A.xanthogrammica crude extract on the proliferation of SPC-A1 cells（，n＝3）

表1 黃海葵粗提物對SPC-A1細(xì)胞的增殖抑制率（，n＝3）Tab 1 Inhibitory rate of A.xanthogrammica crude extract on the proliferation of SPC-A1 cells（，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

表1 顯示，在一定的質(zhì)量濃度作用范圍內(nèi)，增加黃?？痔嵛锏馁|(zhì)量濃度和延長相互作用的時(shí)間，SPC-A1細(xì)胞抑制率會(huì)逐漸增高，具有顯著的時(shí)間與劑量依賴性。當(dāng)作用時(shí)間一致時(shí)，隨著黃?？|(zhì)量濃度的增加，其對SPC-A1 細(xì)胞的抑制率逐漸增高。作用72 h 后，0.625、1.25、2.5 mg/ml 黃?？麑?xì)胞的抑制率分別達(dá)到18.4%、59.8%、82.1%；當(dāng)黃?？痔嵛镔|(zhì)量濃度為2.5 mg/ml，作用時(shí)間為24、48、72 h時(shí)，細(xì)胞抑制率分別為58.8%、77.2%、82.1%。作用24、48、72 h的IC50分別為1.81、1.32、1.18 mg/ml（IC50值越小則表明抑制效果越好）。這表明，黃海葵粗提物對人肺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈時(shí)間與劑量依賴性。

3.2 倒置顯微鏡下SPC-A1細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

倒置顯微鏡下SPC-A1細(xì)胞形態(tài)變化見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下SPC-A1細(xì)胞形態(tài)變化（×200）A.正常對照組；B.0.625 mg/ml組；C.1.25 mg/ml組；D.2.5 mg/ml組Fig 1 Morphological changes of SPC-A1 cells observed by inverted microscop（e×200）A.normal control group；B.0.625 mg/ml group；C.1.25 mg/ml group；D.2.5 mg/ml group

圖1 顯示，空白對照組SPC-A1 細(xì)胞生長良好，形態(tài)飽滿，呈上皮樣生長，邊界清楚。藥物作用后，細(xì)胞皺縮，體積縮小變圓，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞黏著力下降，部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml時(shí)，細(xì)胞失去了正常形態(tài)，部分細(xì)胞破裂，培養(yǎng)液中可見明顯的細(xì)胞碎片及顆粒物，部分細(xì)胞壞死。

3.3 HE染色觀察結(jié)果

HE染色SPC-A1細(xì)胞的形態(tài)變化觀察結(jié)果見圖2。

圖2 HE染色觀察SPC-A1細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果（×400）A.正常對照組；B.0.625 mg/ml組；C.1.25 mg/ml組；D.2.5 mg/ml組Fig 2 Morphological changes of SPC-A1 cells observed by HE staining（×400）A.normal control group；B.0.625 mg/ml group；C.1.25 mg/ml group；D.2.5 mg/ml group

圖2 顯示，空白對照組SPC-A1 細(xì)胞大小均勻，核仁數(shù)目多。隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出不規(guī)則。當(dāng)藥物濃度為0.625 mg/ml 時(shí)，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，核仁數(shù)目減少；當(dāng)藥物濃度為1.25 mg/ml時(shí)，細(xì)胞體積明顯縮小，出現(xiàn)胞芽，核固縮，部分細(xì)胞核消失；當(dāng)藥物濃度為2.5 mg/ml時(shí)，細(xì)胞形態(tài)各異，大部分細(xì)胞核溶解，消失，存在的細(xì)胞核也進(jìn)一步固縮，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化。

3.4 AO/EB 熒光染色觀察結(jié)果

AO/EB熒光染色的觀察結(jié)果見圖3。

圖3 AO/EB 熒光染色結(jié)果（×200）A.正常對照組；B.0.625 mg/ml組；C.1.25 mg/ml組；D.2.5 mg/ml組Fig 3Results of AO/EB stainin（g×200）A.normal control group；B.0.625 mg/ml group；C.1.25 mg/ml group；D.2.5 mg/ml group

圖3 顯示，空白對照組細(xì)胞大小均勻，胞核呈現(xiàn)出均勻的綠色熒光。用藥后細(xì)胞均不同程度發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)變化，0.625 mg/ml 組呈現(xiàn)出黃綠色熒光；1.25 mg/ml 組的異常細(xì)胞顯著增多，胞核呈現(xiàn)出較強(qiáng)的黃綠色熒光或黃色熒光；2.5 mg/ml 組細(xì)胞體積明顯縮小，部分細(xì)胞核消失，部分細(xì)胞核偏向細(xì)胞一側(cè)，核固縮呈月牙形，出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞核被染成桔紅色熒光。

4 討論

海洋生物中蘊(yùn)藏著大量結(jié)構(gòu)新穎、藥用價(jià)值獨(dú)特的新型藥物，是巨大的天然藥源寶庫。目前，已從海洋生物中分離并鑒定出了許多結(jié)構(gòu)新穎的抗腫瘤活性物質(zhì)，這顯示出了巨大的研究開發(fā)及應(yīng)用前景[9-11]。?？鳛槲覈睾８挥械囊环N海洋動(dòng)物，其觸手和身體中含有眾多的刺細(xì)胞，其中有儲(chǔ)存著毒液的細(xì)胞器——刺絲囊，當(dāng)海葵遇到物理或化學(xué)刺激時(shí)，刺絲會(huì)刺入獵物身體并釋放毒液而麻痹獵物，用于捕抓獵物或抵御敵害。而其中所含的?？窠?jīng)毒素、?？芗?xì)胞素及?？x子通道抑制劑等生物活性物質(zhì)，備受學(xué)者們的關(guān)注[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)通過反復(fù)凍融及丙酮分級(jí)沉淀提取方法獲得黃海葵粗提物，通過MTT法檢測該粗提物對人肺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖抑制作用，并采用HE 染色和AO/EB 熒光染色觀察加藥后的細(xì)胞形態(tài)變化。MTT 法結(jié)果表明，該粗提物能抑制SPC-A1細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)作用時(shí)間與藥物濃度的依賴性。加藥后的SPC-A1細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞周圍出現(xiàn)胞芽現(xiàn)象即凋亡小體，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，核仁數(shù)目減少，細(xì)胞核固縮或溶解消失，這些形態(tài)學(xué)的變化，說明黃?？痔嵛锬芤种芐PC-A1 細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)凋亡，而腫瘤細(xì)胞的凋亡是抗癌藥物的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。鑒于海葵原料的低價(jià)與易得，其抗腫瘤活性物質(zhì)有望發(fā)展成為一種新型的海洋抗腫瘤藥物。接下來筆者將對黃?？痔嵛锏木唧w抗癌成分進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化、鑒定，并探討其相關(guān)的抗癌機(jī)制。

[1]張淑瑜，易楊華，湯海峰，等.?？縿?dòng)物化學(xué)成分及生物活性的研究概況[J].中國海洋藥物，2002，21（3）：48.

[2]管華詩，王曙光.中華海洋本草：3冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2009：25.

[3]史文軍，秦松，張朝暉，等.?？瘜W(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2013，37（12）：122.

[4]袁兆新，孫明莉，趙冰，等.?？舅貙ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2006，23（5）：594.

[5]Ramezanpour M，da Silva KB，Sanderson BJ.Venom present in sea anemone（Heteractis magnifica）induces apoptosis in non-small-cell lung cancer A549 cells through activation of mitochondria-mediated pathway[J].Biotechnol Lett，2014，36（3）：489.

[6]胡波.海葵溶細(xì)胞素Gigantoxin-4的分離、鑒定和功能研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2011.

[7]楊林，榮明強(qiáng)，劉少華，等.舟山黃?？d奮性毒素AX-1的分離純化及鑒定[J].中國海洋藥物，2012，31（2）：25.

[8]劉少華，楊林，章晨，等.舟山黃?？麣⑾x活性多肽的初步研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，29（6）：566.

[9]曾名勇，崔海英，李八方.海洋生物活性肽及其生物活性研究進(jìn)展[J].中國海洋藥物，2005，24（1）：46.

[10]劉力力，閆征，郭舉，等.海鞘素簡易結(jié)構(gòu)類似物GJ7-1 和GJ7-2 的抗腫瘤活性及分子靶向研究[J].中國藥房，2014，25（29）：2 705.

[11]強(qiáng)薇，梅剛.真菌中環(huán)二肽及其衍生物的抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].中國藥房，2014，25（21）：2 007.

[12]Tabakmakher VM，Monastyrnaya MM，Leichenko EV，et al.Biologically active polypeptides of sea anemones：structure，function，and prospects for application[J].Russian Journal of Marine Biology，2013，39（5）：311.

[13]Fedorov S，Dyshlovoy S，Monastyrnaya M，et al.The anticancer effects of actinoporin RTX-A from the sea anemone heteractis crispa radianthus macrodactylus[J].Toxicon，2010，55（4）：811.