范仕郡，祝元鋒，楊永軍，劉　鑫　(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院中心實驗室，重慶 400038)

·論著·

AMPK信號通路在調節(jié)小鼠骨髓巨噬細胞抗菌性自噬效應中的作用

范仕郡，祝元鋒，楊永軍，劉鑫(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院中心實驗室，重慶 400038)

[摘要]目的觀察AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)對小鼠骨髓巨噬細胞自噬及殺菌活性的調節(jié)作用,并探討其可能機制。方法分離和體外培養(yǎng)小鼠原代骨髓巨噬細胞(BMDM)，觀察大腸埃希菌刺激后對BMDM細胞自噬水平及AMPK活化狀態(tài)的影響。使用AMPK激動劑和抑制劑干預其活化，進一步觀察大腸埃希菌感染的BMDM細胞中AMPK活化、自噬水平以及殺菌能力的變化。結果大腸埃希菌感染后的小鼠BMDM細胞自噬相關分子LC3B和Beclin1的表達顯著升高，同時LC3Ⅱ/Ⅰ比值也明顯升高，且其AMPK的磷酸化水平也隨之顯著上調。AMPK活性增強后，能夠進一步上調BMDM細胞的自噬水平以及對細菌的降解清除。而AMPK活性被抑制后，細胞自噬水平和殺菌活性均顯著下降。結論AMPK分子及其相關信號通路可能在調節(jié)巨噬細胞自噬水平以及抗菌效應方面發(fā)揮重要作用。

[關鍵詞]AMPK；小鼠骨髓巨噬細胞；抗菌性自噬

自噬(autophagy)是一種細胞內的“自食(self eating)”現(xiàn)象[1-2]。細胞通過形成雙層膜結構的自噬體，包裹胞質和細胞器、蛋白質等物質并將其轉運至溶酶體進行降解清除，以維持細胞的穩(wěn)態(tài)[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)，在天然免疫細胞中，自噬體還可包裹和清除入侵細胞內的病原體，這一作用也被稱為抗菌性自噬作用(antibacterial autophagy)[4-5]。目前有關抗菌性自噬的調控機制尚未完全闡明。AMP依賴的蛋白激酶(5’ adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶分子，在機體生物能量代謝調節(jié)中發(fā)揮關鍵性作用[6-7]。近來研究發(fā)現(xiàn)，AMPK對于自噬和炎癥的調節(jié)也至關重要[8-9]。然而該通路是否與免疫細胞中抗菌性自噬效應的調節(jié)有關，目前尚不清楚。本文以小鼠骨髓巨噬細胞為研究對象，觀察AMPK通路對于細胞自噬功能及抗菌效應的影響，以期闡明調節(jié)免疫細胞抗菌性自噬作用的可能機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及主要試劑雄性BALB/c小鼠，體質量(20±2) g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。大腸埃希菌標準菌株ATCC35218購自美國ATCC公司。胰蛋白胨、酵母提取物、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、saponin(細胞裂解液)、AICAR(AMPK激動劑)和Compound C(AMPK抑制劑)等購自美國Sigma公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自美國GIBCO公司。反轉錄試劑盒和SYBR定量PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司。LC3B、AMPK、pAMPK、F4/80、tubulin抗體購自美國CST公司。RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、彩色預染蛋白marker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、4%多聚甲醛溶液、DAPI(細胞核染液)及BSA等購自碧云天生物科技有限公司。Trizol 總RNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司，生理鹽水購自西南藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2主要儀器設備恒溫搖床、電泳儀、定量PCR儀、核酸蛋白儀、高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)、細菌計數系統(tǒng)、普通孵箱、CO2孵箱、倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓巨噬細胞(bone marrow derived macrophage, BMDM)的分離及體外培養(yǎng)BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡1 min，取出瀝干酒精放置于方盤，將小鼠后肢的皮毛剝至足部，剪下后肢并放置在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，剔除肌肉，在關節(jié)處剪斷股骨和脛骨，用1 mL注射器吸取生理鹽水，注入骨髓腔并反復沖洗5次，將骨髓沖洗液轉移至50 mL離心管。4 ℃條件下，1 000 rpm離心5 min，用10 mL含10%血清和50 ng/mL M-CSF的DMEM細胞培養(yǎng)基重懸細胞，轉至T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清，換5 mL含MCSF(50 ng/mL)和DMEM細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d后備用。

1.2.2大腸埃希菌的體外培養(yǎng)及BMDM細胞刺激處理挑取接種于營養(yǎng)瓊脂平板上的大腸埃希菌標準菌株的菌落，轉移至5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，250轉增菌培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.8左右(換算所得菌液濃度為5×107/mL～8×107/mL)，離心棄上清，PBS洗滌2次并重懸菌液。將菌液按照與細胞比例為10∶1加入BMDM細胞中，孵育1 h后PBS洗滌細胞3次，加入AMPK或SIRT1的激動劑或抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后洗滌細胞3次，加入0.3% saponin裂解細胞，稀釋后取100 μl涂布于營養(yǎng)瓊脂平板。

1.2.3免疫熒光染色將小鼠BMDM細胞以4%多聚甲醛固定，1%BSA室溫封閉1 h，加入F4/80的一抗(1∶400稀釋)。

1.2.4熒光定量PCR檢測自噬相關基因的mRNA表達將小鼠BMDM細胞加入1 mL Trizol裂解液，離心取上清按照試劑盒說明書提取總RNA。行反轉錄及realtime-PCR反應，通過2-ΔΔCt的方法計算LC3B和Beclin1基因對于內參基因β-actin的相對定量比值[10]。

1.2.5western blot檢測自噬相關蛋白的表達將小鼠BMDM細胞加入RIPA培養(yǎng)基，離心取上清胞漿蛋白，蛋白定量后經SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉，一抗(1∶1 000)過夜孵育，加入二抗(1∶2 000)并進行化學發(fā)光曝光處理。

1.3統(tǒng)計學處理

2結果

2.1小鼠BMDM細胞的形態(tài)及鑒定

小鼠骨髓細胞經分離培養(yǎng)后，在M-CSF的刺激下逐步增殖分化為BMDM細胞，培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下可觀察到細胞呈橢圓形、多角形或不規(guī)則形，部分貼壁。培養(yǎng)48 h后可以觀察到細胞貼滿培養(yǎng)瓶，大部分出現(xiàn)偽足。部分細胞伸展開并牢固黏附在培養(yǎng)瓶表面，細胞呈現(xiàn)明顯的梭形，貼壁良好。通過免疫熒光結合激光共聚焦顯微鏡方法檢測巨噬細胞標志物F4/80(紅色)，發(fā)現(xiàn)細胞幾乎均為陽性著色，提示分化細胞的純度較好(圖1～2)。

a:小鼠BMDM細胞24 h形態(tài);b:小鼠BMDM細胞48 h形態(tài)

a:F4/80(紅色);b:DAPI(藍色);c:合并

2.2大腸埃希菌對BMDM細胞胞內自噬水平和AMPK的磷酸化水平的影響

大腸埃希菌作用于小鼠BMDM細胞后，自噬相關蛋白LC3B和Beclin1的mRNA表達較未處理組細胞顯著上調(P<0.01)。同時經western blot檢測發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌也可上調LC3Ⅱ/Ⅰ比值，表明大腸埃希菌能夠上調BMDM細胞的自噬水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌還可促進AMPK的磷酸化，提示其誘發(fā)的自噬可能與上調AMPK的活化水平有關(圖3)。

2.3AMPK對小鼠骨髓巨噬細胞的自噬水平和大腸埃希菌胞內降解的影響

為明確AMPK通路是否對小鼠巨噬細胞的抗菌性自噬效應具有調控作用，我們采用AMPK激動劑AICAR(1 mM)和抑制劑Compound C(10 μM)處理大腸埃希菌感染的BMDM細胞，觀察到AICAR作用后可進一步上調LC3B的表達以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，同時胞內活菌數目較單獨大腸埃希菌感染組細胞顯著降低(P<0.01)，而Compound C則可下調LC3B的表達以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P<0.05)，同時胞內活菌數目較單獨大腸埃希菌感染組細胞顯著升高(P<0.01)，見圖4～5。

*:與medium組比較，P<0.01

圖3大腸埃希菌(EC)對BMDM細胞自噬水平以及AMPK活化的影響

*:與EC組比較，P<0.05;#:與EC組比較，P<0.01

圖4AMPK激動劑(AICAR)和抑制劑(Compound C)對大腸埃希菌(EC)感染BMDM細胞自噬水平的影響

3討論

自噬的激活對于胞內細菌的清除具有重要意義，然而引發(fā)細胞抗菌性自噬的調控機制尚未闡明[11-12]。

*:與EC組比較，P<0.01

圖5AMPK激動劑(AICAR)和抑制劑(Compound C)對BMDM胞內大腸埃希菌(EC)降解的影響

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌感染后的小鼠BMDM細胞，其自噬水平顯著升高，同時AMPK的磷酸化水平也顯著上調。而通過化學抑制劑的方法增加或抑制AMPK的活性，能夠影響B(tài)MDM細胞的自噬水平以及對細菌的降解清除，提示AMPK分子及其相關信號通路可能在調節(jié)細胞自噬水平以及抗菌免疫反應方面發(fā)揮重要作用。

為對吞噬細胞中抗菌性自噬效應進行研究，我們參考文獻報道，對小鼠骨髓巨噬細胞(BMDM)的分離和分化方法進行了摸索[13]，并通過活細胞染色和細胞表面標志物檢測的方法對獲得的BMDM細胞進行了活力和純度分析，最終建立滿足后續(xù)研究需求的細胞分離和體外培養(yǎng)方法。

近來發(fā)現(xiàn)，天然免疫細胞的自噬水平與其介導的炎癥反應和殺菌活性密切相關[14]。吞噬細胞自噬水平的上調，可增強對結合分支桿菌和沙門氏菌等胞內寄生菌的降解清除[15]。大腸埃希菌雖不是特有的胞內寄生菌，但其也可侵入吞噬細胞中，引發(fā)細胞凋亡，影響對細菌的吞噬和殺傷。免疫功能低下的患者注射免疫球蛋白后，其外周血中心粒細胞的自噬水平顯著提高，進而對多重耐藥的大腸埃希菌殺傷能力也明顯增強[16]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，使用熒光標記的大腸埃希菌與小鼠骨髓巨噬細胞共孵育后，可在胞內觀察到吞噬入胞的大腸埃希菌，且與自噬體發(fā)生了明確的共定位現(xiàn)象。在本研究中，我們進一步證實，大腸埃希菌可上調自噬相關分子LC3B和Beclin1的表達，且能夠增加LC3Ⅱ/Ⅰ的比值。該結果提示，大腸埃希菌能夠直接誘導巨噬細胞自噬的發(fā)生。

AMPK是細胞能量代謝的核心調控分子。近來發(fā)現(xiàn)，AMPK分子也直接參與了對細胞自噬的調控。AMPK可抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Targer of Rapamycin, mTOR)的活性，同時激活Beclin1/PI3KⅢ復合物，激活細胞自噬效應[8]。大量研究顯示，AMPK分子在能量代謝和腫瘤相關的自噬調控中具有重要作用[17]。但其是否參與了對細菌介導的自噬效應的調控，目前尚不明確。因此我們首先檢測了小鼠BMDM細胞中AMPK分子的活化水平。結果顯示，大腸埃希菌處理的小鼠BMDM細胞中，AMPK分子的磷酸化水平明顯增加。上述結果提示，AMPK分子可能對大腸埃希菌介導的巨噬細胞自噬反應具有調控作用。為明確該設想，我們使用AMPK的激動劑AICAR和抑制劑Compound C改變其活性，觀察對細胞自噬和細菌降解作用的影響[18-19]。結果顯示，AMPK激動劑能夠增加其磷酸化水平，同時進一步上調自噬分子LC3B的mRNA表達和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(相對于單獨的細菌處理組)。與此相反的是，AMPK的抑制劑Compound C可下調LC3B的表達和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值。在細菌計數實驗中，我們進一步發(fā)現(xiàn)，AMPK激活后，BMDM胞內活菌數量顯著降低，而AMPK受抑制后，胞內活菌數量顯著升高。該結果表明，AMPK對小鼠巨噬細胞的殺菌作用具有正調控效應。該結果與AMPK對自噬的調節(jié)作用一致，提示AMPK可能通過上調細胞自噬水平，進而增強殺菌活性。

綜上，本研究對引發(fā)細胞抗菌性自噬的調控機制進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)了大腸埃希菌對小鼠巨噬細胞自噬水平的上調效應，并證實該作用與其激活AMPK分子，進而上調自噬相關分子的表達和活化有關。我們同時也發(fā)現(xiàn)，AMPK分子的活化，還能夠直接影響巨噬細胞細胞對細菌的降解清除，提示AMPK分子及其相關信號通路可能在調節(jié)細胞自噬水平以及抗菌免疫反應方面發(fā)揮重要作用，并有可能是機體抗感染免疫應答的重要信號機制之一。

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(編輯：楊穎)

Role of AMPK signaling pathway in regulating antibacterial autophagy in murine bone marrow derived macrophages

FAN Shi-jun，ZHU Yuan-feng，YANG Yong-jun，LIU Xin

(Medical Research Center, Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the regulatory effects and possible mechanisms of autophagy induction and bactericidal activity in muring bone marrow derived macrophages (BMDMs). MethodsMurine BMDMs were isolated and cultured in vitro.Then standard strain of E.coli was used to infect BMDMs and cellular autophagy levels and AMPK activation were detected.We next modulated functions of AMPK by pretreating cells with the specific agonist or antagonist of AMPK.Then cellular AMPK activation, autophagy levels and bactericidal activity were observed after E.coli infection. ResultsIn E.coli infected BMDMs,autophagy related molecules like LC3B and Beclin1 were upregulated,accompanied with elevated LC3Ⅱ/Ⅰratio.Phosphorylation of AMPK was also upregulated by E.coli treatment.Enhanced AMPK activity by its agonist leads to increased cellular autophagy and bactericidal activity,whereas inhibition of AMPK by its suppressor downregulated autophagy and dampened bactericidal activity. ConclusionAMPK and its related signaling pathway is required for anti-bacterial response in macrophage,which is dependent on its function in upregulating autophagy related molecules and inducing autophagy.

[中圖分類號]R446.63;Q813.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)06-0591-04

[收稿日期]2015-09-29[修回日期] 2015-10-10

[基金項目]國家自然科學基金(81202566)

doi:10.11659/jjssx.09E015136

Kewords: AMPK；murine bone marrow derived macrophages (BMDM)；antibacterial autophagy