楊傲傲 朱 玲① 周春婭 楊 洪 駱曉蕊 劉春勝 莊志猛

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306; 2. 農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071)

海蜇(Rhopilema esculentum)和沙海蜇(Nemopilema nomurai)同屬于刺胞動物門(Cnidaria)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae), 廣泛分布于西北太平洋沿岸海域, 在我國主要分布于東海北部和黃、渤海海域(董婧等, 2012)。海蜇隸屬于海蜇屬(Rhopilema), 目前作為國際公認品質最好的可食用大型水母, 具有極高的經濟價值。同時, 海蜇也是我國重要海洋漁業(yè)捕撈、增養(yǎng)殖和放流對象(謝忠明等, 2004)。而沙海蜇屬于沙蜇屬(Nemopilema), 經濟價值較低, 但是作為世界上最大的水母之一, 是我國近海暴發(fā)的主要大型災害性水母(程家驊等, 2004)。近年來, 沙海蜇頻繁暴發(fā)于黃海海域及東海北部海域。沙海蜇的大量暴發(fā)性增殖, 一方面嚴重改變了自然海洋生態(tài)系統(tǒng)的結構與功能, 另一方面也嚴重影響了其它海洋漁業(yè)資源產量以及正常的海洋漁業(yè)生產, 而且對濱海旅游和工業(yè)活動等都產生了重要影響(孫松等, 2012)。

海蜇和沙海蜇的生活史復雜, 從受精卵到成體,經歷浮浪幼蟲、螅狀體、橫裂體、碟狀體和水母體五個發(fā)育階段, 不同發(fā)育階段之間個體形態(tài)、結構差異顯著(董婧等, 2012)。已有的研究結果表明: 沙海蜇與海蜇的水母體階段可以根據(jù)傘徑大小、外傘表面特征和附屬器形態(tài)等直接用肉眼區(qū)分(洪惠馨, 2002)。但是在浮浪幼蟲、螅狀體、橫裂體和碟狀體階段, 海蜇和沙海蜇的形態(tài)、結構特征極為相似, 幾乎難以區(qū)別。盡管孫明等(2010)在實驗室條件下對沙海蜇與海蜇晚期碟狀體的形態(tài)特征進行研究, 認為可以通過比較生殖腺、胃絲和口腕等的細微形態(tài)差異進行區(qū)分(孫明等, 2010)。但由于水母具有含水量多, 采集易破碎, 保存易變形、失真等特點, 導致這種方法在野外采樣后難以應用。

本文基于海蜇轉錄組454 GS FLX測序與PCR技術, 在海蜇和沙海蜇中分別克隆了包含 EST-SSR和EST-SNP標記的β-連環(huán)蛋白(β-catenin) 基因的目的片段, 并進行了生物信息學分析, 期望從分子水平上尋找一種簡單、準確甄別海蜇和沙海蜇的分子標記,為海蜇和沙海蜇種群的棲息地調查、資源量或潛在暴發(fā)量的評估奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 海蜇轉錄組 454 GS FLX測序與β-連環(huán)蛋白基因的篩選

在浙江杭州灣采集野生性成熟的海蜇, 立即運回山東榮成養(yǎng)殖場進行海蜇人工繁育。分別選取海蜇不同發(fā)育階段的個體(螅狀體、橫裂體、碟狀體和幼蟄)提取總RNA, 并等比例混合, 然后采用SMARTTMcDNA Library Construction (Clontech)試劑盒構建海蜇cDNA文庫。由美國夏威夷大學的ASGPB實驗小組利用 Roche Next Generation Sequencer GS FLX System (a.k.a. 454 Sequencer)進行半板454 GS FLX測序。生物信息學分析后, 篩選與其它生物β-連環(huán)蛋白基因具有高度相似性的海蜇β-連環(huán)蛋白基因序列。

1.2 海蜇和沙海蜇樣品的采集與基因組DNA提取

海蜇和沙海蜇樣品分別采自青島沙子口和膠州灣。液氮保存返回實驗室后, 采用酚-氯仿法提取基因組DNA: 每個個體分別取約200mg液氮保存的樣品進行研磨, 研磨至粉末狀后, 立即加入 600μL的DNA提取液[其中Tris-HCl (pH 8.0) 100mmol/L, EDTA(pH 8.0) 100mmol/L, 1% SDS 50μL, 20mg/mL 蛋白酶K 8μL], 充分混勻, 55°C水浴 1—2h, 待組織充分裂解完全。加入等體積的酚-氯仿試劑[其中飽和酚、氯仿、異戊醇以體積比為25︰24︰1混合], 靜置10min,12000r/min離心10min, 除去上清。如此反復抽提三次。然后加入0.6體積的異丙醇靜置5min, 12000r/min離心 5min, 除去上清。加入 600μL已預冷的無水乙醇, 沉淀 DNA約 30min后, 70%乙醇洗滌沉淀兩次,自然干燥2min, 加入20μL超純水溶解。提取的DNA經1.5%瓊脂糖電泳進行檢測。

1.3 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段的克隆與測序

利用軟件SSRhunter 1.3 (http: //www.bio-soft.net/dna/SSRHunter.htm)識別海蜇β-連環(huán)蛋白基因序列中的微衛(wèi)星重復的位置和重復單位的形式。然后利用Primer Premier 5.00在微衛(wèi)星重復序列的兩翼設計一對特異性引物β-catenin-F1 (5'-TATCAAACCAGGC ATGTCCACC-3')和β-catenin-R1 (5'-GCCCAGACCT ACCAAGATGA A-3'), 分別擴增海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的目的片段。50μL的PCR反應體系包括:5μL 10×PCR buffer, 4μL dNTP (25mmol/L), 3μL MgCl2(25mmol/L), 上下游引物各 2μL (10μmol/L),0.4μL (1U) DNA Taq 酶, 2μL DNA 模板, 31.6μL PCR水; PCR反應條件為: 94°C預變性5min, 36個PCR循環(huán)(包括: 94°C變性45s, 53°C退火45s, 72°C延伸45s),最后 72°C總延伸10min。反應結束后, 用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴增產物, 對目的片段進行切膠回收后, 與 pMD18-T載體(TaKaRa)連接, 轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞(Top10)中。最后通過藍白斑篩選陽性克隆, 對陽性克隆送華大基因公司進行測序(每個物種隨機選取10個體); 剩余PCR擴增產物用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.4 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段的生物信息學分析

運用 BLAST技術(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和蛋白分析系統(tǒng)(http: //www.expasy.org/), 作者分析了海蜇β-連環(huán)蛋白基因的cDNA和氨基酸序列。用ClustalW (http: //www.ebi.ac.uk/clustalw/)對海蜇和沙海蜇群體的β-連環(huán)蛋白基因片段進行多序列比對, 識別海蜇與沙海蜇的SSR特征序列和單核苷酸多態(tài)位點。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳與圖譜分析

PCR擴增產物通過6%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳55W, 2.5h, 然后銀染, 顯色, 拍照, 根據(jù)DNA長度標準 pBR322/MspI, 確定等位基因的長度范圍。采用Genepop 4.0統(tǒng)計等位基因數(shù), 計算表觀雜合度和期望雜合度, 進行哈迪-溫伯格平衡背離測試, 并進行成對標記間連鎖不平衡測試。

2 結果與分析

2.1 海蜇β-連環(huán)蛋白基因的篩選與同源性分析

生物信息學分析表明, 在半板海蜇454 GS FLX轉錄組測序結果中, 共有7個Est序列與其它生物β-連環(huán)蛋白基因具有高度相似性。將上述 EST序列拼接后, 共獲得長1833 bp的海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段。推導的氨基酸序列經 BLAST分析發(fā)現(xiàn), 海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段與來自刺胞動物門的 Hydractinia echinata (ACZ51403)、Podocoryna carnea (ABI74628)、Hydra magnipapillata (AFI99111)和Hydra vulgaris(AAQ02885)的β-連環(huán)蛋白基因具有很高的同源性,其氨基酸序列一致性高達 84%—89%。與長牡蠣Crassostrea gigas (AFL93714)、海鞘 Ciona savignyi(BAA32789)和 文 昌 魚 Branchiostoma floridae(BAD12593)的氨基酸序列一致性也分別高達 79%、78%和82%。

2.2 海蜇β-連環(huán)蛋白基因微衛(wèi)星篩選與PCR擴增

利用軟件 SSRhunter 1.3搜索拼接后的海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段, 在序列 342—360bp處發(fā)現(xiàn)一個微衛(wèi)星序列, 其重復單位為(TGC)6。分別以海蜇和沙海蜇的基因組 DNA為模板, 用海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段的一對特異性引物β-catenin-F1和β-catenin-R1進行PCR擴增并測序, 結果顯示: 10個海蜇個體的β-連環(huán)蛋白基因擴增片段的大小分別為166bp和169bp, 其中169bp與已知的β-連環(huán)蛋白cDNA序列的大小相同,表明擴增的目標片段中沒有內含子存在。而10個沙海蜇個體的β-連環(huán)蛋白基因擴增片段的大小分別為157bp和160bp。

2.3 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段特征分子標記分析

海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的目的片段核苷酸多序列比對見圖1。比對結果顯示, β-連環(huán)蛋白基因在海蜇和沙海蜇中是高度保守的, 海蜇個體β-連環(huán)蛋白基因目的序列之間, 除了微衛(wèi)星重復差異外, 只有一個堿基的差異; 而沙海蜇個體之間除了微衛(wèi)星重復差異外, 其余完全一致。海蜇和沙海蜇的β-連環(huán)蛋白基因目的片段之間, 在相同位置上都存在微衛(wèi)星重復, 但所包含的微衛(wèi)星重復單元截然不同, 海蜇為:(TGC)4-6(TGT)1-2(TGC)4-5, 而海蜇為(TGT)5-6。除此之外,海蜇和沙海蜇的β-連環(huán)蛋白基因目的片段之間還存在 14個能夠甄別兩物種的單核苷酸多態(tài)位點, 分別為: (T/C)1, (T/C)2, (C/T)3, (C/T)4, (C/T)5, (T/G)6,(G/C)7, (T/G)8, (A/G)9, (C/T)10, (G/A)11, (A/G)12,(C/T)13, (A/T)14。

表1 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的多態(tài)微衛(wèi)星位點的特征Tab.1 Characteristics of SSR from β-catienin in R. esculentum and N. nomurai

2.4 微衛(wèi)星位點的多態(tài)性分析

根據(jù) DNA長度標準 pBR322/MspI, 在聚丙烯酰胺凝膠上, 海蜇和沙海蜇群體的 PCR擴增產物長度主要分布在166 bp和160 bp, 見圖2。遺傳學分析顯示: 該位點在海蜇和沙海蜇群體中的期望雜合度分別為 0.4998和 0.7482, 表觀雜合度分別為 0.5208和0.7083, 等位基因數(shù)均為2。通過哈迪-溫伯格平衡背離測試, Bonferroni校正后均未發(fā)現(xiàn)偏離現(xiàn)象(表1)。

3 討論

隨著分子生物技術和生物信息學的快速發(fā)展,利用DNA分子標記對海蜇與沙海蜇進行物種鑒定、探討物種分類地位及種間親緣關系已經成為傳統(tǒng)分類學的重要輔助手段。劉敏等(2010, 2011)分別利用18S rDNA序列和COI序列對東黃海沙海蜇與口冠水母分類關系進來了辨析, 認為東黃海野生沙海蜇與越前水母的親緣關系很近, 應為同一物種, 與海蜇的親緣關系較遠, 與口冠水母的關系更遠。張姝等(2009)也利用16S rDNA和COI基因序列對海蜇和沙海蜇進行了分子鑒定, 認為線粒體基因作為分子標記可能是解決水母幼體分類困擾的有效途徑之一。本研究在海蜇轉錄組454 GS FLX測序基礎上, 通過對EST序列的深度解析, 在β-連環(huán)蛋白基因序列中發(fā)掘出同時包含EST-SSR和EST-SNP兩種分子標記的目的片段,只需要設計一對引物, 分別從海蜇和沙海蜇的基因組 DNA中擴增出目的片段, 經聚丙烯酰胺凝膠電泳即可進行海蜇和沙海蜇的物種甄別。該方法不但簡單、快速、準確, 同時也為EST-SSR和EST-SNP分子標記在物種鑒定和親緣關系分析中的應用提供了一種新思路。

基于EST序列開發(fā)的EST-SSR標記與從基因組開發(fā)的SSR標記相比, 具有以下優(yōu)點: a) EST-SSR是在已有的 EST序列中進行篩選, 所以該開發(fā)過程不僅簡單, 成本也低; b) EST-SSR標記通常來自較為保守的轉錄區(qū), 故而開發(fā)出的分子標記在近緣物種間具有較高的通用性和可轉移性; c) EST-SSR 代表基因的編碼部分, 因此可作為功能基因的“絕對”的標記, 也可用于直接鑒定一些決定重要表型性狀的等位基因; d) 通過序列同源性比對, 可以分析獲得EST-SSR標記的某種可能功能(Scott et al, 2000;Areshehenkova et al, 2002)。本研究所獲得的β-連環(huán)蛋白基因分子標記正是利用了 EST-SSR的這些優(yōu)點。β-連環(huán)蛋白作為 Wnt/β-catenin信號通路的核心成員,幾乎參與了生物體從胚胎到成體所有的發(fā)育過程(Peifer, 1997)。例如調控細胞的增殖和生長(Logan et al, 2004)、保障各種干細胞的功能(Willert et al, 2005)、參與細胞的分化(Prestwich et al, 2007)、控制胚胎早期發(fā)育(Klaus et al, 2008)等。通過對目前已在GenBank注冊的β-連環(huán)蛋白進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn): 這個位于β-連環(huán)蛋白基因C末端的SSR重復序列僅存在于刺胞動物海蜇、沙海蜇及 H. echinata(ACZ51403)中, 其它動物類群均不存在。盡管目前尚不知道這個微衛(wèi)星序列對β-連環(huán)蛋白的生物功能的影響, 但越來越多證據(jù)表明, 位于編碼區(qū)的SSR序列或者直接影響基因編碼產物功能(Ellegren, 2000;Huang et al, 2002), 或者通過與轉錄因子結合進而調控基因表達(Bachtrog et al, 2000), 或者通過影響局部染色質結構等發(fā)揮著重要作用(Dupuy et al, 2004)。已有研究表明, β-連環(huán)蛋白的C末端與核轉錄因子淋巴樣增強因子-1/T-細胞因子的結合, 形成轉錄復合物,進入細胞核后激活下游基因的表達, 發(fā)揮轉錄因子的作用(Kuhl et al, 2001), 因此推測該微衛(wèi)星序列可能通過與轉錄因子結合進而調控基因表達, 從而參與刺胞動物的發(fā)育過程(Bachtrog et al, 2000)。

圖1 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段的核苷酸多序列比對Fig.1 Multiple alignment of β-catienin target nucleotide sequences from R. esculentum and N. nomurai

圖2 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的多態(tài)微衛(wèi)星圖譜Fig.2 SSR profile from β-catienin in R. esculentum and N. nomurai populations

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