王忠良 丁 燏 許尤厚 簡(jiǎn)紀(jì)常 魯義善王 蓓 陳 剛 吳灶和,

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524088; 2. 廣東海洋大學(xué)南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湛江 524088; 3. 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(欽州學(xué)院) 欽州 535000; 4. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湛江 524088; 5. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 廣州 510225)

馬氏珠母貝(Pinctada martensii)又稱合浦珠母貝(Pinctada fucata), 是人工培育海水珍珠的主要母貝。自 1965年我國(guó)成功開(kāi)展馬氏珠母貝人工育苗以來(lái),海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速, 尤其是進(jìn)入20世紀(jì)90年代后, 海水珍珠養(yǎng)殖已成為廣東、廣西和海南沿海地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)(史兼華等, 2006; Wang et al, 2009)。然而, 由于長(zhǎng)期的人工養(yǎng)殖和近親繁殖, 馬氏珠母貝種質(zhì)已呈現(xiàn)明顯的退化現(xiàn)象, 如種苗活力下降、死亡率增加、育珠貝變小、珍珠質(zhì)量差等(Miyazaki et al, 1999;Tomaru et al, 2001; He et al, 2008)。為改善這一狀況,馬氏珠母貝的遺傳改良和優(yōu)良品種培育是當(dāng)前海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的首要任務(wù), 而篩選穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記評(píng)價(jià)其遺傳多樣性對(duì)馬氏珠母貝良種選育和種質(zhì)資源保護(hù)都具重要的指導(dǎo)意義。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats, SSR),又稱微衛(wèi)星DNA, 是指由1-6個(gè)核苷酸組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)DNA序列(Powell et al, 1996; Liu et al, 2013)。與諸多分子標(biāo)記相比, 具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、多等位性、共顯性和可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn), 已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、基因定位、遺傳多樣性、分類與進(jìn)化及分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域(趙瑩瑩等, 2006; 徐美佳等, 2009; 李云峰等, 2010;孫國(guó)華等, 2010; 劉博等, 2012; 王東等, 2014)。根據(jù)來(lái)源, SSR標(biāo)記又可分為基因組 SSR(Genomic SSR,gSSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽 SSR(Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)兩種。與gSSR標(biāo)記相比, EST-SSR標(biāo)記無(wú)需構(gòu)建基因組文庫(kù), 節(jié)省了大量人力物力, 開(kāi)發(fā)成本較低, 且來(lái)源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū), 其多態(tài)性與基因功能可能直接相關(guān), 同時(shí)在相近物種間具良好的通用性(Varshney et al, 2005; 李琪, 2006; 張瓊等,2010)。

近年來(lái), 隨著EST和cDNA大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展, 多種海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類 SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)利用研究已相繼展開(kāi)(李紅蕾等, 2003; Sato et al, 2005; 李琪,2006; 李云峰等, 2010), 但現(xiàn)有的SSR標(biāo)記還非常有限, 仍不能滿足進(jìn)一步研究的需要。為此, 本文基于前期Illumina高通量測(cè)序技術(shù)獲得的馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表), 利用計(jì)算機(jī)軟件輔助進(jìn)行大規(guī)模EST-SSR標(biāo)記的發(fā)掘, 并對(duì)其組成、分布及特征等信息進(jìn)行了分析, 同時(shí)對(duì) SSR標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行了評(píng)價(jià), 以期為馬氏珠母貝遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建及分子輔助育種研究提供有效工具, 促進(jìn)馬氏珠母貝種質(zhì)資源保護(hù)、優(yōu)良品種培育和珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 馬氏珠母貝的暫養(yǎng)及血細(xì)胞采集

馬氏珠母貝(平均殼長(zhǎng) 70mm)購(gòu)自廣東省湛江市徐聞邁陳珍珠貝養(yǎng)殖場(chǎng), 暫養(yǎng)于室內(nèi)玻璃鋼水槽中(200L水體), 每槽飼養(yǎng)20只; 水溫25°C, 鹽度28, 飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣; 暫養(yǎng)過(guò)程中以螺旋藻粉為餌料投喂,每天換水(100%)一次; 室內(nèi)暫養(yǎng)一周后采集血淋巴。

利用 1mL無(wú)菌注射器于馬氏珠母貝閉殼肌處采集血淋巴, 每只 0.5mL; 采集的血淋巴分裝至 1.5mL離心管中, 每管1mL; 4°C, 800g 離心10min 收集血細(xì)胞, 并立即進(jìn)行DNA提取。

1.2 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源

馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于課題組前期利用Illumin/Hiseq-2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)馬氏珠母貝血細(xì)胞進(jìn)行的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得70407878條原始讀數(shù)(Raw reads), 經(jīng)去除含有接頭、重復(fù)及測(cè)序質(zhì)量較低的原始讀數(shù)后, 獲得 56345139條純凈讀數(shù)(Clean reads)。使用轉(zhuǎn)錄組de novo組裝軟件Trinity(Grabherr et al, 2011)對(duì)Clean reads進(jìn)行組裝,并進(jìn)行去冗余處理和進(jìn)一步拼接, 共得到74007條非冗余獨(dú)立基因(Unigene)。(以上轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)尚未發(fā)表,轉(zhuǎn)錄組Raw reads已提交至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù), 登錄號(hào)為SRP041567。)

1.3 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)篩選

為檢測(cè)馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組中 EST-SSR位點(diǎn), 使用軟件MIcroSAtellite (MISA) (Lu et al, 2013)對(duì)組裝得到的Unigenes序列進(jìn)行SSR 搜索和定位。所檢測(cè)SSR 位點(diǎn)共6類, 分別為單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù), 其篩選標(biāo)準(zhǔn)為: 單核苷酸重復(fù)≥10次; 二核苷酸重復(fù)≥6次; 三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)≥5次。

1.4 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR引物設(shè)計(jì)

使用Primer3軟件進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì), 每條SSR產(chǎn)生3對(duì)引物; 引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)設(shè)置如下: 引物長(zhǎng) 18—23bp, 最適長(zhǎng)度 23 bp; PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100—300bp; GC含量40%—65%, 最適含量50%; 退火溫度55—65°C, 最佳退火溫度55°C。

1.5 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR多態(tài)性檢測(cè)

1.5.1 模板DNA的制備 采用Universal Genomic DNA Mini-Isolation Kit試劑盒(上海生工生物工程有限公司), 并按照說(shuō)明書方法進(jìn)行血細(xì)胞 DNA的提取。經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后, –20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) 為了篩選和驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的SSR引物, 隨機(jī)挑選80對(duì)引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成), 以上述血細(xì)胞DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包括2×ES Taq MIX 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL, 模板DNA 1 μL, ddH2O補(bǔ)足至 20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min, 30個(gè)循環(huán)(94°C變性30s, 最佳Tm退火 30s, 72°C延伸 30s), 最后 72°C 延伸 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染法顯色進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的分布及頻率

利用MISA軟件對(duì)馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組中的74007條Unigenes序列進(jìn)行搜索, 共檢測(cè)到9872個(gè)SSR位點(diǎn), 分布于8135條Unigenes序列中。SSR 發(fā)生頻率(含SSR的Unigene數(shù)/Unigene總數(shù))為10.99%, SSR出現(xiàn)頻率(檢出SSR位點(diǎn)數(shù)/Unigene總數(shù))為13.34%;平均每5102bp含有1個(gè)SSR位點(diǎn)(檢測(cè)序列總堿基數(shù)50368155 bp)。其中, 1350條Unigene含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn), 復(fù)合型SSR數(shù)目為518個(gè)。

馬氏珠母貝 EST-SSR重復(fù)類型豐富, 除六核苷酸重復(fù)外, 1—5核苷酸重復(fù)均有發(fā)現(xiàn)。其中, 單核苷酸重復(fù)有4種類型, 二核苷酸重復(fù)有11種類型, 三核苷酸重復(fù)有 52 種類型, 四核苷酸重復(fù)有 58種類型,五核苷酸重復(fù)有7種類型(表1)。從各類型SSR位點(diǎn)數(shù)量看, 出現(xiàn)最多的為 1—3核苷酸重復(fù), 占總 SSR位點(diǎn)數(shù)的98.32%。其中, 單核苷酸重復(fù)比例最高, 占81.46%; 其次為二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù), 分別占10.48%和6.38%; 4—5核苷酸重復(fù)SSR數(shù)量較少,共占 1.68%(表 1)。

表1 馬氏珠母貝EST-SSRs不同重復(fù)基元分布情況Tab.1 Distribution of different repeat motifs of EST-SSRs in P.martensii transcriptome

馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組中 EST-SSR的長(zhǎng)度在 12—20bp的有3677條, 其中單核苷酸重復(fù)SSR共計(jì)2226條; 長(zhǎng)度超過(guò)20bp的SSR有336條, 并以單核苷酸重復(fù)SSR最多, 達(dá)129條(表2)。SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)方面, 以重復(fù) 10次(3883)最多, 占總 SSR位點(diǎn)的39.33%; 其次為重復(fù)11次和12次, 分別占17.12%和8.88%; 重復(fù)5—9次、13—17次及18—24次的SSR位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1671、1279和472(圖1)。

2.2 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的特征

在馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組9872個(gè)SSR位點(diǎn)中, 共檢測(cè)到 132種重復(fù)基元(表 1)。其中, 以單核苷酸重復(fù)基元 A/T和 C/G最多, 分別占總 SSR的 71.27%和10.19%, 發(fā)生頻率分別為 9.507%和 1.359%; 其次為二核苷酸重復(fù)基元AT/AT和AG/CT, 分別占4.66%和4.24%; 三核苷酸重復(fù)單元中, 以 ATC/ATG、AAG/CTT和AAC/GTT出現(xiàn)次數(shù)最多, 分別占總SSR的2.07%、1.29%和1.16%; 四核苷酸和五核苷酸重復(fù)基元種類較多, 但數(shù)量較少, 頻率較低, 共占SSR總數(shù)的 1.67%(表 3)。

表2 馬氏珠母貝EST- SSRs長(zhǎng)度分布情況Tab.2 Lengthdistribution of EST-SSRs in P. martensii transcriptome

圖1 馬氏珠母貝EST-SSRs重復(fù)次數(shù)分布圖Fig.1 Distribution of EST-SSR repeats frequency in P.martensii transcriptome

2.3 馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組EST-SSR引物設(shè)計(jì)及多態(tài)性檢測(cè)

為更好地利用馬氏珠母貝 SSR位點(diǎn), 本文應(yīng)用Primer3軟件對(duì)上下游序列均不小于 150 bp的EST-SSR設(shè)計(jì)引物, 每條序列產(chǎn)生 3對(duì)引物。經(jīng)SSRFinder校驗(yàn)及除去不符合條件的引物后, 共為5922條EST-SSR序列成功設(shè)計(jì)出17766對(duì)引物, 占馬氏珠母貝SSR總數(shù)的59.99%。

從上述設(shè)計(jì)引物中隨機(jī)挑選 80對(duì)引物, 并以隨機(jī)挑選的20只健康馬氏珠母貝血細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證設(shè)計(jì)的EST-SSR引物。結(jié)果表明, 共有 62對(duì)引物成功擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶, 占引物總數(shù)的 77.5%, 但其中有 23對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段與預(yù)期產(chǎn)物片段大小不符; 在62個(gè)SSR位點(diǎn)中, 以二堿基、三堿基重復(fù)類型的 SSR位點(diǎn)擴(kuò)增成功率較高; 此外, 17對(duì) EST-SSR引物(占擴(kuò)增引物總數(shù)的21.25%)表現(xiàn)出個(gè)體多態(tài)性(表 4), 多態(tài)性比率為27.42%; 17對(duì)多態(tài)性引物所在SSR位點(diǎn)中, 有7個(gè)為二堿基重復(fù), 6個(gè)為三堿基重復(fù), 2個(gè)為單堿基重復(fù),四堿基重復(fù)和五堿基重復(fù)各1個(gè)。

3 討論

目前, 有關(guān)貝類微衛(wèi)星標(biāo)記的研究主要是通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)來(lái)獲得含有微衛(wèi)星的序列, 并且設(shè)計(jì)引物對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行篩選(Sato et al, 2005; 李春艷等, 2009)。如石耀華等(2008)從馬氏珠母貝9個(gè)組織的SMART cDNA文庫(kù)中共獲得6979條EST序列, 并篩選到268個(gè)SSR位點(diǎn), SSR出現(xiàn)頻率為3.48%; 同樣, 李云峰等(2010)從蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis) cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了74個(gè)SSR重復(fù)序列(2007條EST序列), SSR出現(xiàn)頻率為3.69%。與上述傳統(tǒng) EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)技術(shù)相比, 基于高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的 SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)技術(shù)不僅可以借助更全面的數(shù)據(jù)信息, 提高遺傳多樣性研究的準(zhǔn)確性, 而且開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記同樣具有EST-SSR標(biāo)記的諸多優(yōu)點(diǎn)。王學(xué)穎(2012)從馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組的99127條無(wú)冗余EST序列中共發(fā)現(xiàn)了6595個(gè)SSR位點(diǎn), SSR出現(xiàn)頻率為6.65%; 同樣, 本文利用 MISA軟件從馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組74007條Unigenes中共檢索出9872個(gè)SSR位點(diǎn), 分布于8135條Unigenes中, SSR出現(xiàn)頻率高達(dá) 13.34%。因此, 結(jié)合其它動(dòng)植物 SSR開(kāi)發(fā)相關(guān)文獻(xiàn)和本研究結(jié)果表明, 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選 SSR標(biāo)記是發(fā)掘非模式生物 EST-SSR的一種快速、高效的方法, 應(yīng)用前景廣闊。

表3 馬氏珠母貝EST-SSRs重復(fù)基元的類型及頻率Tab.3 EST-SSR repeats motifs and the frequency in P. martensii transcriptome

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道, 蝦夷扇貝和馬氏珠母貝的EST-SSR均以二核苷酸重復(fù)基元為主, 其所占比例分別為 40.54%和 48.5% (石耀華等, 2008; 李云峰等,2010); 縊蟶(Sinonovacula constricta)SSR以三核苷酸重復(fù)SSR比列最高, 為37.13%(劉博等, 2012); 此外,基于馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組的 SSR分析中, 四堿基重復(fù)基元占總EST-SSR的40%(石耀華等, 2008)。而本研究中以單核苷酸重復(fù)基元為主, 比列達(dá)到81.46%。造成以上差異的原因, 除EST序列獲取方法不同外(王學(xué)穎, 2012), 在一定程度上與搜索 SSR時(shí)設(shè)置的參數(shù)有很大的關(guān)系(Wei et al, 2011)。Aggarwal等(2007)發(fā)現(xiàn), 如果改變 SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)(提高二核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù), 或降低三核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)), 原本二核苷酸重復(fù) SSR占優(yōu)勢(shì)的研究中, 便會(huì)出現(xiàn)三核苷酸重復(fù)SSR占優(yōu)勢(shì)的情況; 同樣,若本研究中提高單核苷酸 SSR的重復(fù)次數(shù), 則 SSR將以二核苷酸重復(fù)基元為主。因此, 亟需建立一個(gè)統(tǒng)一的 SSR檢測(cè)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)以便有效比較不同研究中同一或相近物種SSR分布的類型與特點(diǎn)。

表4 17對(duì)多態(tài)性EST-SSRs引物序列及擴(kuò)增參數(shù)Tab.4 Sequences and amplification parameters of the 17 EST-SSRs primers

研究表明, SSR標(biāo)記可用性的重要依據(jù)——多態(tài)性的高低, 主要取決于的其長(zhǎng)度大小(李珊等, 2010)。當(dāng)SSR長(zhǎng)度≥20bp時(shí)其多態(tài)性較高, 長(zhǎng)度在12—20bp之間的SSR則呈現(xiàn)中等多態(tài)性, 而長(zhǎng)度＜12bp時(shí)多態(tài)性較低(楊華等, 2011)。本研究中, 長(zhǎng)度在 12—20bp之間的SSR有3677條(占SSR總數(shù)的37.25%), 這些SSR具中等多態(tài)性; 而長(zhǎng)度≥20bp的SSR有336條(占SSR總數(shù)的 3.4%), 此類SSR呈較高的多態(tài)性。此外, 本研究中20bp以上的低級(jí)重復(fù)基元(一、二、三核苷酸重復(fù)基元)較多, 共計(jì) 279條(占 20bp以上SSR的83.04%)。由此可預(yù)見(jiàn)馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組來(lái)源的 SSR具有較高的多態(tài)性潛能, 在分子標(biāo)記研究方面將具有較高的利用價(jià)值(Dreisigacker et al, 2004)。

為檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR的多態(tài)性, 隨機(jī)挑選了80對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 其中62對(duì)引物成功擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶, 但仍有18條引物未能擴(kuò)增出產(chǎn)物。這可能是由于所設(shè)計(jì)的引物序列位于兩個(gè)外顯子上, 或者基因組對(duì)應(yīng)序列含有內(nèi)含子而不具備SSR序列特征等原因造成(Varshney et al, 2005)。此外,本研究出現(xiàn)了 23對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段與預(yù)期產(chǎn)物片段大小不符的現(xiàn)象, 而該現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在櫛孔扇貝和縊蟶的 EST-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物中(李紅蕾等, 2003;劉博等, 2012)。究其原因, 有學(xué)者認(rèn)為其與引物的非特異性結(jié)合(錯(cuò)配)或基因組 DNA序列含有內(nèi)含子等相關(guān)(李紅蕾等, 2003; Saha et al, 2004)。17對(duì)多態(tài)性引物所在SSR位點(diǎn)中, 多為二、三核苷酸重復(fù), 這從某種程度上也驗(yàn)證了低級(jí)重復(fù)基元多態(tài)性高于高級(jí)重復(fù)基元多態(tài)性的推斷(Dreisigacker et al,2004)。

4 結(jié)論

本研究利用馬氏珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 篩選獲得了9872個(gè)EST-SSR位點(diǎn), 位點(diǎn)出現(xiàn)頻率達(dá)13.34%;同時(shí), 共為5922條EST-SSR序列成功設(shè)計(jì)出17766對(duì)引物; 隨機(jī)選擇的 80對(duì)擴(kuò)增引物中, 共有 17對(duì)EST-SSR引物表現(xiàn)出個(gè)體多態(tài)性, 多態(tài)性比率為27.42%。以上研究結(jié)果對(duì)于豐富馬氏珠母貝分子標(biāo)記類型、加速功能基因資源的利用、探究種群遺傳結(jié)構(gòu)、分析遺傳多樣性、保護(hù)種質(zhì)資源和培育優(yōu)良品種均具有重要意義。

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