鄭唐春 臧麗娜 代麗娟 劉彩霞 曲冠證

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

責任編輯:潘 華。

植物的開花是一個高度復(fù)雜而復(fù)合的、在一定遺傳背景控制下的生理生化及形態(tài)發(fā)生過程。表現(xiàn)為植物接受環(huán)境條件誘導(dǎo)、信號傳導(dǎo)、開花決定基因控制及諸多代謝途徑的相互制約下，引起花芽分化，進而導(dǎo)致器官發(fā)生。根據(jù)前期的大量研究，擬南芥中已知有多種遺傳途徑參與成花轉(zhuǎn)變，例如光周期途徑、春化途徑、自主途徑及赤霉素途徑等［1-4］。Flowering Locus C(FLC)和Short Vegetative Phase(SVP)是開花信號整合子的兩個核心調(diào)節(jié)蛋白，它們相互作用能夠調(diào)節(jié)開花信號整合因子。FLC 是MADS-box 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在芽尖和根尖表達［5］，在春化途徑中，F(xiàn)LC 起到關(guān)鍵的作用。擬南芥FLC 突變體和野生型都表現(xiàn)出強烈的春化需求，春化處理后的擬南芥FLC 的表達水平降低，過表達FLC 會導(dǎo)致擬南芥開花延遲［6-7］。SVP 也是開花負調(diào)控蛋白，含有保守的MADS-box，它在植物的整個營養(yǎng)體生長階段中表達，維持營養(yǎng)生長階段，但在花序分生組織中幾乎不表達［8-9］。開花途徑整合因子Flowering Locus T(FT)、Suppressor of Overexpression of Constans 1(SOC1)的啟動表達，能促進植物開花［10-11］。而FLC 和SVP 蛋白既能在莖尖分生組織中抑制SOC1 基因轉(zhuǎn)錄，又能在幼葉中調(diào)節(jié)FT 基因表達，阻止FT 蛋白等開花信號從葉片向分生組織運轉(zhuǎn)［12］。此外FLC 蛋白還會影響開花協(xié)調(diào)因子FLOWERING LOCUS D (FD)的表達，削弱分生組織對開花信號的響應(yīng)［13］。

在1年生的草本植物(如擬南芥、薺菜)中，開花抑制因子FLC 與SVP 已經(jīng)被克隆，且被證實存在特殊的相互作用［14-15］。然而在多年生的林木中，每年的繁殖期會消耗大量的能量，利用開花抑制因子延緩花期的研究尚未見報道。白樺(Betual platyphylla Suk.)又稱樺木，是我國東北地區(qū)的主要樹種。具有耐貧瘩、耐嚴寒、生長快等特性［16-17］。白樺全身都是寶。白樺的木材為家具及造紙?zhí)峁┰?，其樹皮、汁液等也富含多種寶貴的營養(yǎng)成份，是天然的保健藥品。為了延長白樺的營養(yǎng)生長時間，獲得高質(zhì)量的白樺材料，探究白樺的晚花機制至關(guān)重要。本文通過克隆白樺開花抑制因子BpFLC 和BpSVP 基因，并構(gòu)建酵母表達載體，從真核表達水平建立白樺FLC 與SVP 酵的母雙雜交體系，為深入分析白樺FLC 與SVP 間的作用域和互作位點的相互作用等提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白樺幼葉cDNA 由本實驗室保存;E.coli DH5α感受態(tài)菌株購自天根生化科技有限公司(北京);酵母雙雜交表達載體pGBKT7、pGADT7，對照質(zhì)粒pGBKT7- 53、pGBKT7 - lam、pGADT7 - T，酵 母 菌Y2Hgold，酵母省缺培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化試劑均購自Clontech 公司(日本);質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司(美國);PCR 相關(guān)試劑、DNA marker、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Nde I，T4 DNA ligase 連接酶購自TaKaRa 公司(日本);胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、YNB(無氨基酸酵母氮源)購自Amresco 公司(美國);所用引物合成、測序服務(wù)由博仕生物技術(shù)有限公司完成(哈爾濱);其他實驗試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 酵母誘餌載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

1.2.1 目的基因的克隆

根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計特異性引物，BLAST 分析排除異源基因同源性序列，引物序列見表1。以白樺幼葉cDNA 為模板，進行PCR 克隆。反應(yīng)體系:10×Ex PCR buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，Primer-F(10 μmmol/L)1 μL，Primer-R(10 μmmol/L)1 μL，ExTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，cDNA 模板2 μL，加ddH2O 至終體積25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃4 min;94 ℃30 s，58 ℃45 s，72℃1 min 共35 個循環(huán);72 ℃7 min。反應(yīng)完成后取3 μL 反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 酵母誘餌表達載體的構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物利用純化試劑盒純化后，用Nde I和EcoR I 限制性內(nèi)切酶分別酶切目的片段和載體，酶切體系:Nde I 1 μL，EcoR I 1 μL，10×H buffer 2 μL，質(zhì)粒1 μg，加ddH2O 至終體積20 μL。在37 ℃水浴鍋中恒溫處理2.5 h。酶切完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳，用試劑盒膠回收酶切后的目的片段。然后進行目的片段的連接重組，重組體系:10×T4 DNA ligase buffer 1 μL T4 DNA ligase 1 μL，目的片段6 μL，載體2 μL，終體積10 μL。16 ℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，分別涂布含有卡那霉素(pGBKT7 載 體，Kana 50 μg/mL)或 氨 芐 霉 素(pGADT7 載體，Amp 50 μg/mL)的LB 平板培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)14～16 h。然后挑取單克隆進行菌液PCR，提質(zhì)粒進行質(zhì)粒PCR 和酶切鑒定，最后將陽性克隆送往博仕生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.2.3 酵母Y2Hgold 感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化

參考Clontech 公司Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手冊及本實驗室的改良法［18］，采用PEG/LiAc 法依次將重組質(zhì)粒pGBKT7-BpFLC 及pGBKT7-BpSVP 單獨分別轉(zhuǎn)化Y2Hgold 感受態(tài)細胞，涂布SD/-Trp 單缺培養(yǎng)基。將pGBKT7-BpFLC/pGADT7-BpSVP 和pGBKT7-BpSVP/pGADT7-Bp-FLC 分別共轉(zhuǎn)入Y2Hgold 感受態(tài)細胞，平行設(shè)置空白載體對照試驗。轉(zhuǎn)化完成后，分別涂布SD/-Leu/-Trp(DDO)二缺培養(yǎng)基。30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，觀察轉(zhuǎn)化情況。

1.2.4 酵母誘餌載體的自激活及毒性檢驗

在SD/-Trp 單缺培養(yǎng)基上隨機挑取直徑大于2 mm 的單克隆，用50 μL 無菌水重懸后，分別轉(zhuǎn)移至SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp/(DDO)、SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal(TDO/X)、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA/X-α-gal(QDO/A/X)培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d 后觀察平板的生長情況及菌落顏色變化，來檢測誘餌蛋白有無自激活作用。

挑取經(jīng)檢驗的直徑大于2 mm 的單菌落，分別接種與5 mL SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中，30 ℃230～250 r/min，震蕩培養(yǎng)12 h，將過夜菌液以1 ∶100 稀釋后接種于100 mL 的SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)后0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 后吸取菌液3 mL，以新鮮的SD/-Trp 液體培養(yǎng)基為空白對照，用可見光分光光度計在OD600處測定其吸光度，記錄酵母生長情況，分析誘餌蛋白對酵母細胞自身有無毒害作用。

1.2.5 雙雜交驗證蛋白互作

SD/-Leu/-Trp 二缺培養(yǎng)基上隨機挑取直徑大于2 mm 的單克隆，用50 μL 無菌水重懸后，進行菌液PCR 檢驗?zāi)康幕?。同時取2 μL 分別轉(zhuǎn)移至SD/-Leu/-Trp/(DDO)、SD/-Leu/-Trp/His(TDO)、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA(QDO/A)、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA/X-α-gal(QDO/A/X)培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d 后觀察平板的生長情況及菌落顏色變化。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 BpFLC 和BpSVP 基因的克隆及分析

從白樺幼葉cDNA 中成功克隆出白樺BpFLC和BpSVP 基因(圖1)。

圖1 白樺BpFLC 與BpSVP 基因的PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

其中BpFLC 基因(Gene bank 登錄號:KC020112)的ORF 長度為627 bp，編碼208 個氨基酸，預(yù)測的分子量和等電點分別為23.85 kDa 和9.04;BpSVP 基因(Gene bank 登錄號:KP693588)的的ORF 長度為678 bp，編碼225 個氨基酸，預(yù)測的分子量和等電點分別為25.25 kDa 和6.68。同源性分析結(jié)果表明BpFLC蛋白與可可樹TcFLC 相似度最高(76%)，BpSVP 蛋白與山核桃CcSVP 相似度最高(92%)，且SVP 蛋白的保守性高于FLC 蛋白。不同物種間的FLC 結(jié)構(gòu)域分析(http://pfam.sanger.ac.uk/)表明(圖2，3):白樺BpFLC 與BpSVP 均屬MIKC 型蛋白。二者的M 域(MADS-box)均由51(9-59 aa，PF00319;E-value=4.9e-28)個氨基酸組成，K 結(jié)構(gòu)域(K-box)則分別由100(74-173aa，PF01486;E-value=1.5e-15)和104(69-172aa，PF01486;E-value=1.5e-15)個氨基酸組成。兩個蛋白M 域的保守性均高于K 域。信號肽預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)表明:BpFLC 與BpSVP 蛋白的N 端均不含信號肽，不屬于胞外分泌蛋白或膜蛋白。因此，將BpFLC 與BpSVP完整編碼框構(gòu)建酵母表達質(zhì)粒，不會因為分泌蛋白而影響到酵母雙雜交系統(tǒng)中的蛋白相互作用檢測。

圖2 白樺BpFLC 蛋白同源序列比對分析

圖3 白樺BpSVP 蛋白同源序列比對分析

2.2 酵母誘餌表達載體的構(gòu)建及驗證

用Nde I 和EcoR I 對BpFLC、BpSVP 基因PCR產(chǎn)物、酵母空載體pGBKT7、pGADT7 同時進行雙酶切后，用T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，分別獲得重組載體，暫命名為pGBKT7-BpFLC、pGBKT7-BpSVP、pGADT7-BpFLC、pGADT7-BpSVP。提取質(zhì)粒利用載體通用引物(見表1)進行PCR 驗證(圖4)及酶切檢驗(圖5)，并對陽性質(zhì)粒送樣測序。測序結(jié)果表明BpFLC 和BpSVP 基因已經(jīng)分別重組到酵母表達載體中，未發(fā)生堿基突變，至此酵母誘餌表達載體構(gòu)建完成。

圖4 酵母表達質(zhì)粒BpFLC 和BpSVP 基因的PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.3 酵母誘餌表達載體的自激活與毒性檢測

酵母轉(zhuǎn)化3 d 后觀察平板發(fā)現(xiàn)，誘餌載體和空載體對照都在SD/-Trp 上生長，菌落顏色為白色，且長勢良好。而DDO、TDO/X、QTO/A/X 平板上都未見菌落生長，說明酵母誘餌表達載體沒有自激活作用(圖6)。從單缺板上挑取的陽性克隆，與空載體的對照菌在SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中測定的OD600處的吸光度表明，兩者在OD600處的吸光度隨時間先增長后趨于穩(wěn)定，但兩者生長情況變化不顯著，整體生長趨勢相同，說明重組誘餌載體pGBKT7-BpFLC 和pGBKT7-BpSVP 對酵母自身沒有毒害作用(表2)。

圖5 酵母重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖6 酵母誘餌載體的自激活驗證

表2 酵母誘餌蛋白載體的毒性檢驗

2.4 雙雜交蛋白互作的驗證

在酵母Y2Hgold 菌中分別共轉(zhuǎn)pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP 和pGBKT7-BpSVP×pGADT7-Bp-FLC 及空載體對照pGBKT7-BpFLC×pGADT7 和pGBKT7-BpSVP×pGADT7。結(jié)果表明(圖7)上述4種組合均能在DDO 平板上正常生長。進一步試驗表明，酵母雙雜交陰性對照Y2Hgold［pGBKT7-Lam×pGADT7-T］，Y2Hgold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7］和Y2Hgold［pGBKT7-BpSVP×pGADT7］均不能在TDO、QTO/A、QTO/A/X 生長，說明它們不能激活下游的報告基因。而陽性對照Y2Hgold［pGBKT7-53×pGADT7-T］，Y2Hgold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7-

BpSVP］和Y2Hgold［pGBKT7-BpSVP×pGADT7-Bp-FLC］均可以在TDO、QTO/A 平板上生長出菌落，說明在這3 個酵母中的報告基因HIS3、AUR1-C 和ADE2 都能夠被激活。此外，Y2Hgold［pGBKT7-Bp-FLC×pGADT7-BpSVP］還能夠在QDO/A/X 平板上生長，并且菌落呈藍色，而對照均不能生長(圖7)。由此表明:BpFLC 能夠與BpSVP 結(jié)合，啟動了4 個報告基因HIS3、AUR1-C、ADE2、MEL1 的表達。兩個基因互換載體后，仍能激活上述4 個報告基因，說明白樺BpFLC 與BpSVP 存在相互作用。

3 結(jié)論與討論

在植物的生命周期中，由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變是至關(guān)重要的，“開花”是這個轉(zhuǎn)變的開關(guān)。生理學和遺傳學的分析表明開花是由多種環(huán)境因素和內(nèi)源因素共同作用的結(jié)果。開花調(diào)節(jié)途徑中的多種途徑共同調(diào)節(jié)開花途徑整合因子，促使頂端分生組織向生殖器官轉(zhuǎn)變［3-4］。本研究中從白樺中克隆的BpFLC 和BpSVP 基因均編碼MIKC 型蛋白，屬于開花抑制因子。根據(jù)在模式植物擬南芥中的研究表明，F(xiàn)LC 在春化途徑中起到至關(guān)緊要的作用，SVP 參與自主途徑、溫敏途徑和赤霉素途徑的調(diào)控［10，12，19］。這兩個開花抑制因子均能夠與開花促進因子FT 和SOC1 的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平，從而延遲開花時間。最新研究表明一個非生物脅迫應(yīng)答基因MEE3 能夠結(jié)合FLC 的啟動子區(qū)域，激活FLC 的表達［20］。此為還發(fā)現(xiàn)SVP 是在擬南芥的莖尖位置通過減少赤霉素合成來調(diào)控成花轉(zhuǎn)變的［21］。白樺BpFLC 和BpSVP 這2 個蛋白的MADS-box 都高度保守。K-box 的保守性相對較差［22-23］，經(jīng)過生物信息學預(yù)測發(fā)現(xiàn)BpFLC 和BpSVP 均含有3 個連續(xù)的親水α 螺旋。Yang 等［24］對K-box 的研究表明，前2個α 螺旋可能在二聚體結(jié)構(gòu)形成中起決定性作用，但其識別的目標序列的特異性位點仍然未知。

圖7 酵母中BpFLC 和BpSVP 之間相互作用

早期利用酵母雙雜交技術(shù)，將擬南芥AtFLC、AtSVP 基因連入酵母表達載體中，在AH109 中進行雙雜交驗證，結(jié)果表明AtFLC 和AtSVP 存在相互作用［14］。利用最新的轉(zhuǎn)錄組分析及免疫共沉淀結(jié)果也表明AtFLC 與AtSVP 存在直接的作用，且AtSVP也與AtAP1 存在相互作用［25-26］。湯青林等將十字花科的芥菜BjSVP 和BjFLC 也利用酵母雙雜交系統(tǒng)，在酵母菌中通過激活了酵母的4 個報告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1，證實芥菜BjSVP 和Bj-FLC 存在相互作用［15］。并且利用pET 原核表達系統(tǒng)，通過蛋白體外表達以及SDS-PAGE，檢測到芥菜BjSVP 和BjFLC 能形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物，推測BjSVP 和BjFLC 確實存在相互作用［27］。本文中白樺BpFLC 和BpSVP 酵母雙雜交體系的建立，為這二者間的作用結(jié)構(gòu)域和互作位點的篩選提供了一個可靠的技術(shù)平臺。雖然酵母雙雜交篩選高效、應(yīng)用廣泛，但它也存在固有的技術(shù)缺陷，如酵母屬低等真核生物，與高等生物體內(nèi)的蛋白翻譯、折疊與加工等生物過程存在差異;再者酵母雙雜交僅能檢測2 個蛋白間的結(jié)合，不能檢測多個蛋白間的相互作用;另外蛋白自身的自激活造成的假陽性及毒性、分泌性等假陰性結(jié)果也均限制了酵母雙雜交的應(yīng)用［28-29］。為了克服這一技術(shù)缺陷，采用其他原理的研究蛋白互作的技術(shù)，例如體內(nèi)免疫沉淀(Co-IP)或雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)，將會揭示蛋白在體內(nèi)的真實的互作情況，這些也是我們下一步的研究計劃，以進一步確認BpFLC 和BpSVP 之間在體內(nèi)是否存在互作。

綜上，本文首次從林木中克隆出開花抑制因子BpFLC 和BpSVP，并利用酵母雙雜交驗證了BpFLC和BpSVP 存在直接的相互作用。本研究為下一步深入分析白樺FLC 與SVP 間的作用域和互作位點奠定了基礎(chǔ)。

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