劉勝男 劉志華 王玉成

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

責(zé)任編輯:潘 華。

目前，在世界各地，鹽堿、干旱和低溫等逆境條件嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和作物的產(chǎn)量，及人類(lèi)的生活環(huán)境和糧食安全。因此，研究植物抗逆機(jī)理對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要意義。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，已有大量研究表明轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境信號(hào)傳遞過(guò)程中起著非常重要的作用，它通過(guò)調(diào)控植物體內(nèi)特定功能基因的表達(dá)，來(lái)應(yīng)答逆境脅迫［1］。因此，對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白功能的研究是解決植物抗逆的關(guān)鍵所在。

在真核生物中，轉(zhuǎn)錄因子，也被稱(chēng)為反式作用因子，通過(guò)與真核生物基因啟動(dòng)子中的順式作用元件特異性結(jié)合，從而對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程起到激活或抑制作用［2］。Riechmann 和Jakboy 等人研究發(fā)現(xiàn)，堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈蛋白，即bZIP(Basic region/leucine －zipper motif)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最為廣泛且最為保守的一類(lèi)蛋白，在人類(lèi)、動(dòng)物、植物和微生物中均有報(bào)道［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，bZIP 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、種子儲(chǔ)藏、種子成熟、衰老、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、損傷修復(fù)和病菌防御等多種生物學(xué)過(guò)程［5－14］。bZIP 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的核心序列為 AGTC 順式作用元件，其中包括 G 盒(CACGTG)、C 盒(GACGTC)、A 盒(TACGTA)，一些受光、脫落酸(ABA)誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子區(qū)都含有這些元件［15］。轉(zhuǎn)bZIP 基因的植株在高鹽、干旱、低溫和高溫逆境條件下都表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［16］。目前，已從擬南芥、煙草、水稻等大量草本植物中分離獲得bZIP 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子［17］，但木本植物中bZIP 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子功能的研究報(bào)道較少。

檉柳是一種具有極強(qiáng)抗逆能力的木本植物。徐晨曦等人［18］對(duì)檉柳TaelF5A 基因抗逆功能研究發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)}堿、干旱、過(guò)氧化物及重金屬在內(nèi)的多種脅迫具有抵抗能力;李紅艷等［19］研究發(fā)現(xiàn)檉柳lea 和MnSOD 基因具有抗鹽、抗旱能力。目前已有研究表明，檉柳中ERF 乙烯響應(yīng)因子、WRKY 轉(zhuǎn)錄因子及bZIP 轉(zhuǎn)錄因子具有抗逆能力［15，20－21］。

為了進(jìn)一步對(duì)檉柳中抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白活性分析，抗體制備及蛋白與特定元件結(jié)合驗(yàn)證等試驗(yàn)的研究，獲得純化的重組蛋白已成為關(guān)鍵性問(wèn)題;而目前已有的植物蛋白提取方法很難對(duì)專(zhuān)一性蛋白進(jìn)行提取，尤其對(duì)木本植物而言。突破以往原核表達(dá)技術(shù)在微生物及草本植物專(zhuān)一性蛋白獲取實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆檉柳中ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子基因，并將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX －4T －2 中，利用IPTG 誘導(dǎo)并純化重組蛋白，從而獲得了檉柳bZIP1轉(zhuǎn)錄因子蛋白。獲取的專(zhuān)一性bZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白為檉柳bZIP1 轉(zhuǎn)錄因子的抗逆功能研究提供了抗體制備的純化重組蛋白，也為對(duì)檉柳中bZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白活性分析及其與特定元件結(jié)合驗(yàn)證試驗(yàn)提供了前提保障。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)的研究方法也為木本植物專(zhuān)一性蛋白的獲取拓寬了研究思路，提供了方法借鑒。

1 材料與方法

檉柳(Tamarix hispida)由新疆吐魯番沙漠植物園提供;Top10 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京蓋寧生物公司;原核表達(dá)載體pGEX －4T －2 購(gòu)自GE Healthcare 公司;Ex Taq、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自TaKaRa 公司;BamHI，SalI 和T4 DNA ligase 等購(gòu)自Promaga 公司;質(zhì)粒(小量)提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA 公司;其它試劑均購(gòu)自哈爾濱伊士達(dá)生物公司。

1.1 檉柳總RNA 的提取

將扦插3～4 周大的組培檉柳苗用液氮速凍、充分研磨，利用CTAB 法［22］提取檉柳總RNA，并用DNase I 進(jìn)行處理。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 濃度。

1.2 ThbZIP1 基因的擴(kuò)增

根據(jù)ThbZIP1 的基因序列設(shè)計(jì)引物，并在其上游和下游分別引入BamHI 和SalI 的酶切位點(diǎn)，引物序列 為，bZIP1 － F:5’－ TCGGGATCCATGTATCAACCCGTGAGTTC － 3’;bZIP1 － R:5’－ CGATGTCGACCCGAACTGAAACATATCAGCGGT － 3’;其中酶切位點(diǎn)用下劃線表示。以提取的檉柳總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增ThbZIP1 基因;反應(yīng)體系為:RT 產(chǎn)物200 ng，10 ×Ex Taq buffer 2 μL，bZIP1 －F 引物1 μL，bZIP1 －R 引物1 μL，dNTP 0.4 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.3 μL，去離子水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃復(fù)性7 min。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并回收目的片段。

1.3 序列分析

利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)網(wǎng)站查找ThbZIP1 基因的開(kāi)放讀碼框序列;利用Expasy(http://web.expasy.org/cgi－bin/protparam/protparam)在線查找ThbZIP1 基因的分子量和等電點(diǎn);利用Clustalx1 8.3 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收的目的片段和pGEX－4T－2 質(zhì)粒，分別用BamHI 和SalI 進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA 連接酶將ThbZIP1 基因與pGEX －4T －2 質(zhì)粒16 ℃過(guò)夜連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單斑菌液PCR檢測(cè)，挑取單克隆提取質(zhì)粒送交上海生工(http://www.sangon.com/sangon)測(cè)序。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 中。經(jīng)菌液PCR 檢測(cè)后確定的陽(yáng)性克隆保存菌種備用。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

分別在16、30、37 ℃條件下挑取已鑒定的陽(yáng)性克隆，在10 mL 含有50 μg/mL 羧芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中180 r/min 震蕩培養(yǎng)。在OD600為1.7時(shí)，IPTG 分別誘導(dǎo)4 h，收集2 mL 菌液，將收集的菌體4 ℃，12 000 r/min 離心5 min。棄上清，向沉淀中加入200 μL 大腸桿菌蛋白提取液，并在蛋白提取30、40、50、60 min 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集提取液，在4 ℃條件下，12 000 r/min 離心15～20 min，分離沉淀和上清，10% SDS－PAGE 檢測(cè)。

1.6 重組蛋白的純化

取一段6～8 cm 透析袋，在沸水中煮沸10 min后浸泡于50%乙醇溶液10 min，然后用EDTA 溶液和蒸餾水依次沖洗1 次。將脫色后的目的蛋白用刀片切割回收，切割下來(lái)的目的蛋白膠粒置于備好的透析袋中同時(shí)向透析袋中加入Tris － glycine 溶液(pH=8.13)，封好透析袋后，放入預(yù)冷的Tris －glycine 溶液(pH=8.13)的電泳槽中，100 V，電泳透析4 h;每30 min 攪動(dòng)透析袋待考馬斯亮藍(lán)完全從膠粒上脫離下來(lái)時(shí)倒轉(zhuǎn)電源，電泳5 min，停止電泳;將透析袋置于4 ℃的100 mm PBS 溶液中，過(guò)夜處理，期間要緩慢攪動(dòng)。透析結(jié)束后取出透析袋里的液體，并加入等體積的預(yù)冷丙酮，于4 ℃靜置1 h，14 000 r/min，離心30 min。沉淀用適量的10 mm PBS 溶液溶解，10% SDS－PAGE 電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ThbZIP1 基因的擴(kuò)增和序列分析

以檉柳總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為435 bp，與目的片段長(zhǎng)度相符(如圖1)。生物信息學(xué)分析表明，ThbZIP1 基因(GenBank 登錄號(hào)為:FJ752700)ORF 序列長(zhǎng)435 bp，共編碼144 個(gè)氨基酸，分子量為16.5 kDa，等電點(diǎn)為6.60。通過(guò)BlastP 進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守區(qū)從第20 位的氨基酸開(kāi)始，到80 位的氨基酸結(jié)束(如圖2)。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果表明這些氨基酸序列N 末端有一段高保守序列(圖3中黑色背景部分)，即大概由20 個(gè)左右的亮氨酸組成的亮氨酸拉鏈(Leucine Zipper)LZ 區(qū)域;能夠參與寡聚化作用LZ 區(qū)域與堿性區(qū)域(Basic region)緊密相連，并且每7 個(gè)氨基酸的第7 位含有一個(gè)亮氨酸［16］。檉柳bZIP1 保守區(qū)域可以與專(zhuān)一的DNA 序列進(jìn)行相互作用，該區(qū)域?qū)τ赽ZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白的功能具有重要作用(如圖3)。利用MEGA5.1，將ThbZIP1 基因編碼的氨基酸序列與基因庫(kù)中毛果楊(Populus trichocarpa，XP －002301511 和XP －002306888)、大豆(Glycine max，NP － 001237222.1 和AB134674)、小 麥(Triticum aestivum，BAF99134)、擬南芥(Arabidopsis thaliana，XP－002301511)、煙草(Nicotiana tabacum，AAK92214)、木氏 煙(Nicotiana benthamiana，CBM56257)、蘋(píng)果(Malus domestica，ADL36616)、可可(Theobroma cacao，XP－007042116)和甜椒(Capsicum annuum，ABB17073)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。分析表明，ThbZIP1 基因編碼的蛋白與木氏煙的bZIP 蛋白親緣關(guān)系最近，與小麥的bZIP 蛋白親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

圖1 檉柳總RNA 及bZIP1 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖2 ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)

圖3 檉柳ThbZIP1 與其它植物bZIP 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列多序列比對(duì)，其中黑色背景為高度保守序列

2.2 檉柳ThbZIP1 基因表達(dá)載體的構(gòu)建

將引物bZIP1 －F 和bZIP1 －R 擴(kuò)增得到的目的片段用BamHI 和SalI 酶切回收后與酶切線性化載體pGEX－4T －2 連接，經(jīng)菌液PCR 產(chǎn)物電泳檢查條帶與目的條帶位置一致(如圖5)，提取質(zhì)粒再次測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，測(cè)序序列與目的條帶序列比對(duì)完全。分析表明:ThbZIP1 基因的表達(dá)載體pGEXThbZIP1 構(gòu)建成功。

2.3 ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)

構(gòu)建的BL21 －ThbZIP1 陽(yáng)性克隆菌液OD600達(dá)到1.7 左右時(shí)，用濃度為1.0 mmol/L IPTG 分別在16、30、37 ℃條件下，誘導(dǎo)4 h 后，收集2 mL 菌液，并分別在用大腸桿菌蛋白提取液處理30、40、50、60 min 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集提取液，SDS －PAGE 檢測(cè)結(jié)果表明，在沉淀樣品45 kDa 下方的位置處有明顯增粗的條帶，ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子分子量為16.5 kDa，加上表達(dá)標(biāo)簽大小為26 kDa，目的蛋白大小約為42.5 kDa，與預(yù)期相符;對(duì)照菌株BL21 － pGEX 及未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的重組菌株BL21 －ThbZIP1 未見(jiàn)目的條帶，說(shuō)明重組蛋白rThbZIP1 主要以包涵體形式存在(如圖6)。同時(shí)，電泳結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，大腸桿菌蛋白提取液提取時(shí)間為50 min 時(shí)，所獲目的蛋白量最大，占總蛋白76.42%(如圖7)。

圖4 檉柳ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 重組載體pGEX－ThbZIP1 轉(zhuǎn)化后菌液PCR 檢測(cè)

圖6 重組蛋白rThbZIP1SDS－PAGE 電泳檢測(cè)

圖7 不同誘導(dǎo)溫度與不同蛋白提取時(shí)間下檉柳重組蛋白rThbZIP1 SDS－PAGE 電泳檢測(cè)

2.4 電純化法純化目的蛋白rThbZIP1

通過(guò)對(duì)重組蛋白條帶回收，電純化法純化重組蛋白，回收液經(jīng)SDS －PAGE 電泳檢測(cè)得到純度較好的單一蛋白條帶，無(wú)雜帶(如圖8)。

圖8 37 ℃IPTG 誘導(dǎo)后不同蛋白提取時(shí)間重組蛋白rThbZIP1 及重組蛋白rThbZIP1 電純化回收SDS －PAGE 電泳檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

Ji 等人［23］已對(duì)檉柳ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子基因的分子抗逆機(jī)理做了深入研究，而對(duì)ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子蛋白與特定元件的驗(yàn)證試驗(yàn)，如EMSA 等研究還沒(méi)有報(bào)道。臧聞、翟瑩等人［24－25］利用原核表達(dá)的方法分別獲取了小麥“陜253”P(pán)DI 基因的重組蛋白和大豆GmERF6 轉(zhuǎn)錄因子基因的重組蛋白;草本植物利用該方法獲得重組蛋白已有大量文獻(xiàn)記載，但木本植物利用該方法獲取專(zhuān)一性重組蛋白的報(bào)道少之又少。木本植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，利用試劑盒獲取專(zhuān)一性植物蛋白較困難，且效率較低。因而，想要快速高效地獲取純化的重組蛋白，最為簡(jiǎn)便、快速、高效的方法就是利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲取重組蛋白。本實(shí)驗(yàn)中，為了確定ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子最適原核表達(dá)條件，分別對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、大腸桿菌蛋白提取液提取時(shí)間，以及菌體收集數(shù)量等不同參數(shù)進(jìn)行控制變量分析，試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，菌體收集數(shù)量對(duì)重組蛋白表達(dá)量幾乎沒(méi)有影響，大腸桿菌蛋白提取液提取時(shí)間影響也較小，對(duì)蛋白表達(dá)量影響最大的兩個(gè)因素為誘導(dǎo)時(shí)間和溫度(部分試驗(yàn)數(shù)據(jù)未列出)。本實(shí)驗(yàn)是在37 ℃條件下，用濃度為1.0 mmol/L 的IPTG，誘導(dǎo)4 h，大腸桿菌提取液提取50 min，收獲的蛋白提取液，經(jīng)SDS －PAGE 電泳，回收重組蛋白條帶進(jìn)行的后續(xù)純化實(shí)驗(yàn)。以上條件是檉柳ThbZIP1轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白表達(dá)量最大，重組蛋白條帶最為清晰的表達(dá)條件。

目前，蛋白質(zhì)的純化方法根據(jù)不同的參量有不同的方法。根據(jù)蛋白大小不同，分為透析，超濾，離心和凝膠過(guò)濾等;根據(jù)溶解度不同分離純化蛋白的方法分為等電點(diǎn)沉淀和pH 值調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)的鹽析和鹽溶，有機(jī)溶劑分級(jí)分離法，雙水相萃取法和反膠團(tuán)萃取法;根據(jù)電荷不同分離純化蛋白的方法包括電泳和離子層析法;利用選擇性吸附的分離純化方法包括羥磷石灰層析和疏水作用層析;利用配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法包括凝集素親和層析，免疫親和層析，金屬螯合層析，染料配體層析和共價(jià)層析等方法;有研究分析發(fā)現(xiàn)，還有高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析法［26］。本試驗(yàn)采用的電純化法是基于蛋白質(zhì)電荷不同電泳純化法的一種蛋白純化方法。通過(guò)該方法較準(zhǔn)確且單一地回收了重組蛋白，該方法操作原理簡(jiǎn)單，用材簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn);對(duì)于存在于包涵體中蛋白而言，該方法省去了對(duì)包涵體溶解的過(guò)程。但是該方法也存在著一定不足，電純化蛋白法操作時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。

綜上，以原核表達(dá)系統(tǒng)快速獲取重組蛋白，電純化法獲取純化重組蛋白，為更好地在蛋白質(zhì)水平研究ThbZIP1 轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并為木本植物專(zhuān)一性蛋白的獲得提供經(jīng)驗(yàn)借鑒。

［1］ 李紅霞，汪妤，張戰(zhàn)鳳，等.植物轉(zhuǎn)錄因子與作物抗逆脅迫關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)，2013，33(3):613 －618.

［2］ 劉羽佳.擬南芥AtbHLH112 基因調(diào)控植物抗逆機(jī)制的研究進(jìn)展［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，2013.

［3］ Jakboy M，Weisshaar B，Laser W，et al.ZIP transcription factors in Arabidopsis［J］.Trends in Plant Science，2002(7):106 －111.

［4］ Riechmann J L，Heard J，Martin G，et al.Arabidopsis transcription factors:genome wide comparative analysis among eukaryotes［J］.Science，2000，290:2105 －2110.

［5］ Strathmann A，Kuhlmann M，Heinekamp T，et al.BZP1 specifically hetero dimerises with the tobacco bZIP transcription factors BZP2，BZP3/T BZF and BZP4，and is functionally involved in flower development［J］.Plant Journal，2001，28(4):397 －408.

［6］ Sreenivasulu N，Sopory S K，Kavi Kishor P B.Deciphering the regulatory mechanisms of abiotic stress tolerance in plants by genomic approaches［J］.Gene，2007，388(1/2):1 －13.

［7］ Zou M，Guan Y，Ren H，et al.A bZIP transcription factor，OsABI5，is involved in rice fertility and stress tolerance［J］.Plant Molecular Biology，2008，66(6):675 －683.

［8］ Lee S C，Choi H W，Hwang I S，et al.Functional roles of the pepper pathogen-induced bZIP transcription factor，CAbZIP1，in enhanced resistance to pathogen infection and environm ental stresses［J］.Planta，2006，224(5):1209 －1225.

［9］ Rook F，Weisbeek P，Smeekens S.The light regulated Arabidopsis bZIP transcription factor gene ATB2 encodes a protein with an unusually long lecine zipper domain［J］.Plant Molecular Biology，1998，37(1):171 －178.

［10］ Chattopadhyay S，Ang L H，Puente P，et al.Arabidopsis bZIP protein HY5 directly interacts with light-responsive promoters in mediating light control of gene expression［J］.Plant Cell，1998，10(5):673 －683.

［11］ Mallappa C，Yadav V，Negi P，et al.Abasic leucine zipper transcription factor，G-box-binding facto，regulates blue light mediated photomorphogenic growth in Arabidopsis［J］.Biological Chemistry，2006，281:22190 －22199.

［12］ Jonassen E M，Lea U S，Lillo C.HY5 and HYH are positive regulators of nitrate reductase in seedling sand rosette stage plants［J］.Planta，2008，227(3):559 －564.

［13］ Stankovic＇ B，Vian A，Henry Vian C，et al.Molecular cloning and characterization of a tomato cDNA encoding a system-cally wound-inducible bZIP DNA binding protein［J］.Planta，2000，212(1):60 －66.

［14］ Kim H S，Delaney T P.Over-expression of TGA5，which encodes a bZIP transcription factor that interacts with NIM1/NPR1，confers SAR-independent resistance in Arabidopsis thaliana to Peronospor a parasitica［J］.Plant Journal，2002，32(2):151 －163.

［15］ 及曉宇.檉柳ThbZIP1 基因的抗逆分子機(jī)理研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，2012.

［16］ 楊穎，高世慶，唐益苗，等.植物bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展［J］.麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)，2009，29(4):730 －737.

［17］ Singh K B，F(xiàn)oley R C，Oate-Sánchez L.Transcription factors in plant defense and stress responses［J］.Current Opinion in Plant Biology，2002，5(5):430 －436.

［18］ 徐晨曦.檉柳elF5A 基因的抗逆功能研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，2010.

［19］ 李紅艷.檉柳Lea 和MnSOD 基因的抗逆功能研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，2007.

［20］ 劉文進(jìn).檉柳乙烯響應(yīng)因子ThERF1 應(yīng)答高鹽脅迫的調(diào)控機(jī)理［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，2013.

［21］ Zheng Lei，Liu Guifeng，Meng Xiangnan，et al.A WRKY gene from Tamarix hispida，ThWRKY4，mediates abiotic stress responses by modulating reactive oxygen species and expression of stress-responsive genes［J］.Plant Molecular Biology，2013，82:303 －320.

［22］ 王玉成，楊傳平，姜靜.木本植物組織總RNA 提取的要點(diǎn)與原理［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，30(2):1 －4.

［23］ Ji Xiaoyu，Liu Guifeng，Liu Yujia，et al.The bZIP protein from Tamarix hispida，ThbZIP1，is ACGT elements binding factor that enhancesabiotic stress signaling in transgenic Arabidopsis［J］.BMC Plant Biology，2013，13:151 －155.

［24］ 臧聞，董劍，高翔，等.小麥品種陜253PDI 基因的克隆、原核表達(dá)及蛋白純化［J］.麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)，2011，31(5):799 －804.

［25］ 翟瑩，雷婷婷，閆帆，等.大豆GmERF6 基因的原核表達(dá)及重組蛋白純化［J］.大豆科學(xué)，2011，30(6):906 －909.

［26］ 王子佳，李紅梅，弓愛(ài)軍，等.蛋白質(zhì)分離純化方法研究進(jìn)展［J］.化學(xué)與生物工程，2009，26(8):8 －11.