蔡浩斌，黃忠仕，黃岑漢△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣州510405；2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000）

壯藥補(bǔ)精合劑（簡(jiǎn)稱壯精合劑）是壯族民間醫(yī)生根據(jù)壯醫(yī)學(xué)理論的治療原則，從精血論治的角度，用壯藥（土人參、絞股藍(lán)、扶芳藤、大地棕根等）配伍而成的經(jīng)驗(yàn)方。方中重用土人參補(bǔ)精血、清虛熱、調(diào)經(jīng)帶，為填精補(bǔ)血之要藥；扶芳藤通龍路火路，舒筋脈，散淤血、止出血，通路活血以強(qiáng)土人參補(bǔ)精血之勢(shì)；絞股藍(lán)能除虛熱、促食欲，促睡眠，抗疲勞、抗衰老，含有多種人參皂苷和氨基酸，有“南方人參”之稱；大地棕根能補(bǔ)腎填精，活血化瘀，具有補(bǔ)虛通路之效。全方用藥精專，配伍得當(dāng)，劑量適宜，共奏補(bǔ)精益氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效，從而使精氣盛、氣血調(diào)、龍路通。本研究主要根據(jù)最新的衰老發(fā)生機(jī)制及新時(shí)期探討衰老機(jī)制的新途徑，以壯精合劑作用于初老大鼠模型，研究壯精合劑對(duì)初老大鼠行為學(xué)、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等因素的影響，探討壯精合劑抗衰老的作用及其機(jī)制，為開(kāi)發(fā)廣西的抗衰老中草藥及申報(bào)抗衰老新藥提供理論依據(jù)。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用12月齡健康雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量平均（300±20）g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證：SCXK桂2012-0003）。自動(dòng)控制光照，在通風(fēng)、溫度及濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物及試劑 壯精合劑（土人參30g，絞股藍(lán)25g，扶芳藤20g，大地椋根10g）；陽(yáng)性對(duì)照藥：古漢養(yǎng)生精（批號(hào)902630-126904）；標(biāo)準(zhǔn)品：去甲腎上腺素（NE），批號(hào)100169-201103；多巴胺（DA），批號(hào)100070-201006；5-羥色胺（5-HT），批號(hào)111656-50679，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；流動(dòng)相：乙腈、純凈水；磷酸二氫鉀；EDTA-2Na；樣品前處理試劑：高氯酸。

1.1.3 儀器 Morris水迷宮（中國(guó)科學(xué)院藥研所制），微電極腦立體定位儀（WDT-11，西北光明儀器廠）。FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠），高速冷凍離心機(jī)（BACKMAN公司，美國(guó)），高效液相-熒光檢測(cè)器（Waters公司，美國(guó)），電子分析天平（Sartorius公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 采用自然老化法。初老大鼠模型：選12月齡雌性大鼠，采取陰道脫落細(xì)胞涂片巴氏染色，連續(xù)觀察4個(gè)動(dòng)情周期，以陰道細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)動(dòng)情周期長(zhǎng)。之后持續(xù)動(dòng)情、反復(fù)假妊娠時(shí)，作為自然衰老的初老大鼠模型[1-2]。

1.2.2 分組與給藥 將造模成功的50只齡雌性SD初老大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、壯精合劑高劑量組、壯精合劑中劑量組、壯精合劑組低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只?？瞻讓?duì)照組給予純凈水10mL／kg，陽(yáng)性對(duì)照組給予古漢養(yǎng)生精4.8g／kg，壯精合劑低、中、高劑量組分別給予壯精合劑6 g／kg、15g／kg、30g／kg。以上各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)8周。

1.2.3 觀察項(xiàng)目及方法

1.2.3.1 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試[3]采用 Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶行為能力，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。其中定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5d，每天將大鼠面向池壁分別從不同象限（靶象限除外）置入池中，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。大鼠登上站臺(tái)1s后終止記錄，最長(zhǎng)記錄時(shí)間為100s，若大鼠在100s內(nèi)不能上臺(tái)，則引導(dǎo)其登上站臺(tái)適應(yīng)20s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)是在定位航行實(shí)驗(yàn)后撤掉平臺(tái)，然后將大鼠隨機(jī)從不同象限（靶象限除外）面壁置入池中，記錄其在100s內(nèi)的游泳軌跡，穿過(guò)站臺(tái)的次數(shù)，考察大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶。

1.2.3.2 腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的測(cè)定[4-5]采用高效液相-熒光測(cè)定法檢測(cè)大鼠大腦皮層、海馬區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。

1.2.3.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相為水：乙腈（90∶10），其中水相每升含磷酸二氫鉀0.2mol、EDTA-2Na 0.1mol，用磷酸調(diào)pH值至3.0，流速0.5mL／min。發(fā)射波長(zhǎng)338nm，激發(fā)波長(zhǎng)220nm。柱溫：28℃，進(jìn)樣量10μL。在本色譜條件下，NE，DA和5-HT各峰均達(dá)基線分離的效果。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 色譜圖

1.2.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取混合對(duì)照品貯備液適量，置6個(gè)容量瓶中，各加入5%HCLO4稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，使所含對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為0.002、0.010、0.050、0.500、1.000、5.000μg／mL，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣。以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各組分的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。各回歸方程如下：DA；Y＝230 178X＋3 227.2，r＝0.999 9；NE：Y＝219 207X＋2 087.9，r＝0.999 9；5-HT：Y＝386 571X-7 865.5，r＝0.999 9。

1.2.3.2.3 樣品處理 實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處死后，迅速取出全腦，用冰冷生理鹽水沖洗除去血液，濾紙拭干，冰上迅速分離出大鼠大腦皮層、海馬組織，稱質(zhì)量后，加入1mL 5%HClO4，超聲粉碎成10%勻漿，冷凍高速離心14 000r／min 15min，取上清液，即得腦組織樣品。取上清液進(jìn)樣10μL。記錄各樣品的峰面積，代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件處理，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 定位航行：壯精合劑中劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較所用時(shí)間更少（P＜0.05）。壯精合劑高劑量組比空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組所用時(shí)間更少（P＜0.05）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：壯精合劑中劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比次數(shù)更多（P＜0.05）。壯精合劑高劑量組與空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組相比次數(shù)較多（P＜0.05）。結(jié)果說(shuō)明壯精合劑能明顯提高初老大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力，且高劑量組效果最為顯著，見(jiàn)表1。

表1 隱秘平臺(tái)實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表1 隱秘平臺(tái)實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；c：P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較。

組別 定位航行（潛伏期，s）穿越平臺(tái)次數(shù)（n）空白對(duì)照組22.62±4.18 5.15±2.57壯精合劑低劑量組 21.67±3.49 4.51±2.50壯精合劑中劑量組 18.84±3.50a 7.50±1.85a壯精合劑高劑量組 15.14±3.64bc 9.42±2.27bc陽(yáng)性對(duì)照組 18.77±3.90a 7.40±1.88a

大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡類型分為4種：趨向型、直線型、隨機(jī)型、邊緣型。其中每只大鼠共游泳10次，對(duì)比各組大鼠游泳軌跡，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠趨向型、直線型游泳軌跡有63次，空白對(duì)照組大鼠趨向型、直線型游泳軌跡有44次，兩者相比差別顯著（P＜0.05）。壯精合劑中劑量組大鼠趨向型、直線型游泳軌跡有68次，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。壯精合劑高劑量組大鼠趨向型、直線型游泳軌跡有80次，與空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果說(shuō)明壯精合劑能明顯提高衰老大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力，且高劑量組效果最為顯著（表2、圖2）.

2.2 各組大鼠大腦皮層內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量 各組大鼠大腦皮層內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT含量均比空白對(duì)照組高，且壯精合劑高劑量組效果顯著（與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 大鼠Morris水迷宮游泳軌跡類型（n，n＝10）

圖2 Morris水迷宮軌跡圖

表3 各組大鼠大腦皮層內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較（±s，ng／g，n＝10）

表3 各組大鼠大腦皮層內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較（±s，ng／g，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；c：P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較。

組別DA NE 5-HT空白對(duì)照組387.3±84.5 253.6±46.3 114.3±29.1壯精合劑低劑量組 403.8±64.1 287.1±36.5 136.2±25.5壯精合劑中劑量組 468.3±73.8a313.5±41.9b 168.4±33.2b壯精合劑高劑量組 527.3±81.5bc 373.6±46.3bc 211.8±27.7bd陽(yáng)性對(duì)照組 457.5±61.6a328.4±39.1b 166.7±31.1b

2.3 各組大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量 各組大鼠海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT含量均比空白對(duì)照組高，且壯精合劑高劑量組效果顯著（與空白對(duì)照組比較P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較（±s，ng／g，n＝10）

表4 各組大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較（±s，ng／g，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；c：P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較。

組別DA NE 5-HT空白對(duì)照組117.4±32.3 53.6±16.6 44.9±11.5壯精合劑低劑量組 133.1±24.2 67.3±19.2 49.3±15.7壯精合劑中劑量組 168.6±23.1b 74.6±19.3a 63.8±13.1b壯精合劑高劑量組 187.9±21.5bd 108.5±26.4bd 77.4±17.9bd陽(yáng)性對(duì)照組 152.1±31.5a73.5±19.1a56.3±12.6a

3 討 論

衰老是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變，趨向死亡的不可逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[6]。中醫(yī)藥以其獨(dú)特療效，在抗衰老抗氧化的研究中占有越來(lái)越重要的地位。中醫(yī)認(rèn)為衰老主要是腎虛，其次是脾虛，再次是氣血兩虛。所以補(bǔ)腎、健脾、益氣是延緩衰老的基本途徑，活血化淤是延緩衰老的主要方法[7]。

學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級(jí)神經(jīng)功能之一，中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在此過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[8]。其過(guò)程伴隨著復(fù)雜的神經(jīng)生理和生化機(jī)制，其作用機(jī)制與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量密切相關(guān)[9]。研究表明，去甲腎上腺素在記憶保持方面起著重要作用，而改善記憶與多巴胺的釋放有關(guān)[10]。去甲腎上腺素和多巴胺含量的減少是造成學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要原因[11]。它們的前體是酪氨酸和色氨酸，酸性代謝產(chǎn)物有3，4-二羥苯乙酸、5-羥吲哚乙酸等。這些物質(zhì)在正常生物體內(nèi)存在動(dòng)態(tài)平衡，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種生理過(guò)程。分析單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)物質(zhì)可為多種疾病的診斷和治療以及疾病機(jī)制的研究提供重要依據(jù)[12-15]。

在正常情況下，中樞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌保持在一定水平，并且它們相互之間比例協(xié)調(diào)，從而維持功能的穩(wěn)定；隨著機(jī)體的老化，學(xué)習(xí)記憶能力的下降，腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝亦發(fā)生紊亂，出現(xiàn)NE、DA、5-HT含量的下降，提示衰老過(guò)程中腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡遭到破壞，這與一些老年性疾病如帕金森病、老年癡呆及腦功能的減退也有關(guān)[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予壯精合劑灌胃8周以后，各組大鼠大腦皮層及海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT含量均比空白對(duì)照組高，且壯精合劑高劑量組效果顯著。結(jié)合Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明壯精合劑可明顯改善初老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及提高大腦皮層、海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT含量，提示壯精合劑可有效調(diào)整中樞神經(jīng)遞質(zhì)的合成，恢復(fù)大腦皮層、海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，改善大腦皮層、海馬神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的功能，且壯精合劑高劑量效果較好。

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