周明芳，程天民，馮正直

（第三軍醫(yī)大學(xué)：1.護(hù)理學(xué)院臨床護(hù)理學(xué)教研室；2.軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所；3.心理學(xué)院，重慶400038）

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，離不開多種組織和修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及各種調(diào)控因素的參與，機體需在維護(hù)其自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的同時，通過自身的再生能力使其表面連續(xù)性和完整性得以修復(fù)[1-2]。肉芽組織的形成是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵步驟之一，其質(zhì)量的好壞直接影響著創(chuàng)面的修復(fù)愈合程度及其預(yù)后，而肉芽組織的本質(zhì)是豐富的成纖維細(xì)胞以及大量的微血管。通過對新生微血管以及成纖維細(xì)胞的觀察可以評價皮膚創(chuàng)面的愈合情況。筆者前期研究已經(jīng)證實，抑郁可顯著降低創(chuàng)面組織羥脯氨酸的合成，減少膠原纖維的沉積[3]，延緩大鼠皮膚的創(chuàng)面愈合[4]，但未對肉芽組織中微血管及成纖維細(xì)胞的變化情況進(jìn)行觀察。因此，本研究擬動態(tài)觀察抑郁復(fù)合皮膚創(chuàng)傷條件下，大鼠創(chuàng)面組織中新生微血管及成纖維細(xì)胞的消長情況，為進(jìn)一步揭示抑郁影響創(chuàng)面愈合的可能機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠144只，體質(zhì)量170～200g，由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供，根據(jù)建模方法隨機分為單純皮膚創(chuàng)傷組（單創(chuàng)組）、創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組和抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組，每組48只。

1.1.2 主要儀器和試劑 普通切片機、Olympus光學(xué)顯微鏡、顯微照相系統(tǒng)、1%戊巴比妥鈉、10%中性福爾馬林、CD34多克隆抗體（武漢博士德公司）、Vimentin抗體、DAB顯色試劑盒、SP免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉生物技術(shù)公司）等。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備 抑郁模型的制備參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，包括電擊足底（36V交流電，每隔1min刺激1次，每次刺激10s，共20次）、45℃熱刺激或4℃冰水游泳5min（創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組不接受冰水游泳）、水平搖晃15min、夾尾1min、禁食24h、禁水24h、束縛24h、晝夜顛倒等共9種刺激，每日1種，共18 d。為使刺激具有不可預(yù)見性，隨機安排刺激順序及刺激時間。皮膚創(chuàng)傷制備方法如下：麻醉并剃凈大鼠背部正中毛發(fā)，用自制圓形不銹鋼打孔器切除其背部直徑2.2cm全層皮膚。抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組在完成18d的慢性刺激后，于第19天行皮膚造創(chuàng)；創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組則在制備皮膚創(chuàng)傷后次日開始接受隨機安排的慢性刺激18d。

1.2.2 創(chuàng)面組織微血管、成纖維細(xì)胞計數(shù)方法 選取8個時相點，分別為傷后1、3、5、7、10、14、18、21d，取創(chuàng)緣與正常交界處皮膚組織，10%中性福爾馬林固定標(biāo)本后行石蠟包埋切片。分別采用CD34、Vimentin抗體行免疫組織化學(xué)標(biāo)記。微血管判斷方法：獨立的典型血管內(nèi)皮細(xì)胞著色但尚未形成管腔者、與鄰近微血管或其他組織分界清楚的任一染成棕黃或棕褐色的單一內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，作為一條微血管計數(shù)。低倍顯微鏡下隨機選擇5個血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞染色密集區(qū)域，然后在高倍視野下計數(shù)所選5個區(qū)域，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用±s表示，行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面局部微血管數(shù)比較 CD34抗體免疫組織化學(xué)檢測顯示，傷后第3天起，單創(chuàng)組和創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組創(chuàng)面微血管數(shù)即顯著高于抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組 （P＜0.05）；而創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組與單創(chuàng)組在傷后7d內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），該兩組間微血管計數(shù)在傷后第10天呈現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；各組創(chuàng)面微血管生長達(dá)高峰的時相點為傷后14d，其中，以單創(chuàng)組最多，抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組最少。其后的微血管消退速度以創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組和抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組較慢，單創(chuàng)組較快；3組的微血管數(shù)在傷后第21天比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1，圖1。

表1 各組創(chuàng)面微血管計數(shù)結(jié)果 （±s，個／高倍視野）

表1 各組創(chuàng)面微血管計數(shù)結(jié)果 （±s，個／高倍視野）

a：P＜0.01，與創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與單創(chuàng)組比較；d：P＜0.05，e：P＜0.01，與抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組比較。

時間 單創(chuàng)組（n＝48）創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組（n＝48）抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組（n＝48）第3天 5.00±1.41 5.33±1.03d 3.17±0.75b 7.33±1.97 7.50±2.17 5.33±1.63第5天 9.33±1.86 9.00±2.00d 6.17±1.17b第7天 14.00±1.41 12.50±1.87e 9.33±1.03c第10天 18.33±1.51a 15.33±1.75d 12.67±1.21c第14天 24.17±1.72a 19.67±2.07 17.67±1.75c第18天 14.33±2.42 13.50±2.51 10.83±1.47b第21天

圖1 CD34抗體免疫組織化學(xué)檢測創(chuàng)傷后10d各組創(chuàng)面微血管生長情況（×400）

圖2 Vimentin免疫組織化學(xué)檢測創(chuàng)傷后7d各組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生長情況（×400）

表2 各組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞計數(shù)結(jié)果（±s，個／高倍視野）

表2 各組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞計數(shù)結(jié)果（±s，個／高倍視野）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組比較；c：P＜0.05，d：P＜0.01，與單創(chuàng)組比較；e：P＜0.05，f：P＜0.01；與抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組比較。

時間 單創(chuàng)組（n＝48）創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組（n＝48）抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組（n＝48）第3天24.00±5.69 23.33±6.25 16.17±4.92第5天 340.00±64.80 319.67±72.55e 217.67±54.16c第7天 796.17±87.51 682.00±108.42f 395.50±94.81d第10天 1 277.50±141.26a1 056.83±107.13f 733.33±128.73d第14天 731.67±66.19 786.50±61.78f 1 071.00±89.55d第18天 258.67±72.88a 377.50±62.27e 519.00±81.98d第21天 23.33±6.71b 128.17±41.91e 79.17±25.87c

2.2 創(chuàng)面成纖維細(xì)胞計數(shù)結(jié)果 Vimentin免疫組織化學(xué)檢測顯示，3組大鼠傷后第1天，創(chuàng)面局部均未見明顯成纖維細(xì)胞增殖；傷后第3天，單創(chuàng)組和創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組創(chuàng)面局部成纖維細(xì)胞數(shù)雖多于抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；傷后第5～10天，此差異進(jìn)一步增大，單創(chuàng)組和創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組成纖維細(xì)胞數(shù)顯著多于抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組，而單創(chuàng)組和創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組間在傷后第10天才出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；傷后第18～21天，3組間成纖維細(xì)胞數(shù)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2，圖2。

3 討 論

3.1 抑郁復(fù)合皮膚創(chuàng)傷對創(chuàng)面微血管生長的影響 良好的血運是創(chuàng)面修復(fù)得以順利進(jìn)行的必要條件，血管發(fā)生是創(chuàng)面愈合過程的中心環(huán)節(jié)之一。新生微血管作為肉芽組織的重要組成成分，在創(chuàng)面愈合過程中有著非常重要的作用[6]。創(chuàng)面愈合過程中，組織所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)不僅需由新生微血管提供，同時，它還通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌促血管生長因子，從而縮短創(chuàng)面愈合時間，加快創(chuàng)面愈合速度[7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34目前被廣泛應(yīng)用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記[8-10]。因此，本研究中的新生血管標(biāo)記采用CD34多克隆抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：各組創(chuàng)面新生肉芽組織中的毛細(xì)血管數(shù)自傷后3d起均有增加，但以抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組增加最少；各組創(chuàng)面微血管生長高峰時間為傷后14d，同樣，以抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組最少，單創(chuàng)組最多；其后，各組肉芽組織中微血管數(shù)量逐漸減少，與單創(chuàng)組比較，其余兩組的微血管消退速度相對較慢。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因，可能是由于單創(chuàng)組的創(chuàng)面愈合速度短于創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組及抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組。在傷后18d左右，單創(chuàng)組的創(chuàng)面已基本愈合完畢，肉芽組織逐漸發(fā)展為正常皮膚組織，過剩的毛細(xì)血管網(wǎng)退化代之以正常小血管，而創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組及抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組尚處在創(chuàng)面愈合過程中，局部組織仍需得到更多血液供給。

3.2 抑郁復(fù)合皮膚創(chuàng)傷對創(chuàng)面成纖維細(xì)胞增殖的影響 成纖維細(xì)胞作為肉芽組織的主要成分細(xì)胞，同微血管一樣，在創(chuàng)面愈合過程中扮演著重要角色[11]。有學(xué)者稱其為創(chuàng)面修復(fù)的建筑者、工程師和管理員，它既可分化為肌成纖維細(xì)胞，通過收縮創(chuàng)面、分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和多種生長因子參與創(chuàng)面修復(fù)，也可生成膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維，并分泌膠原酶等參與肉芽形成和創(chuàng)面修復(fù)后的組織改建過程[12-13]。因此，成纖維細(xì)胞一直是創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點[14-15]。本研究結(jié)果表明，自傷口愈合起始階段，單創(chuàng)組和創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組大鼠創(chuàng)面局部成纖維細(xì)胞數(shù)量就高于抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組。而與單創(chuàng)組及創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組傷后10d創(chuàng)面成纖維細(xì)胞增殖達(dá)高峰的時間相比，抑郁復(fù)合創(chuàng)傷組則推后了4d，至傷后14d才達(dá)高峰，增長速度顯著慢于其余兩組。傷口愈合早期，成纖維細(xì)胞數(shù)量在創(chuàng)傷復(fù)合抑郁組和單創(chuàng)組間未出現(xiàn)差異的原因，可能是由于刺激時間較短，尚不足以造成大鼠的抑郁狀態(tài)所致。隨著刺激次數(shù)增加及刺激時間的延長，大鼠逐漸出現(xiàn)抑郁，創(chuàng)面成纖維細(xì)胞的變化才得以體現(xiàn)。

創(chuàng)面愈合是炎性細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等多因素共同參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程[1，14]。本研究結(jié)果初步證實抑郁復(fù)合皮膚創(chuàng)傷可使創(chuàng)面微血管及成纖維細(xì)胞的生長受到抑制，這可能是抑郁造成創(chuàng)面愈合困難的重要原因之一，但對于確定其影響創(chuàng)面愈合的機制，還需進(jìn)一步深入研究。

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