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        雙酚A聯(lián)合鎘亞慢性染毒對(duì)未成年雌性小鼠生殖內(nèi)分泌干擾作用

        2015-03-07 07:12:06何慶峰李宏李燕杰張平平張愛琳吳海清
        生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2015年3期
        關(guān)鍵詞:雙酚染毒雌性

        何慶峰,李宏,李燕杰,張平平,張愛琳,吳海清

        1. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津,300384 2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福州,350101 3. 天津農(nóng)學(xué)院計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院,天津,300384

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        雙酚A聯(lián)合鎘亞慢性染毒對(duì)未成年雌性小鼠生殖內(nèi)分泌干擾作用

        何慶峰1,*,李宏2,李燕杰3,張平平1,張愛琳1,吳海清1

        1. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津,300384 2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福州,350101 3. 天津農(nóng)學(xué)院計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院,天津,300384

        目前,針對(duì)雙酚A(BPA)或鎘(Cd)內(nèi)分泌干擾毒性的研究很多,但是關(guān)于其聯(lián)合作用的研究則較少。將昆明雌性幼鼠分為4組,分別為對(duì)照組、BPA組、Cd組及聯(lián)合組,灌胃染毒5周,觀察小鼠動(dòng)情周期、卵巢組織抗氧化水平、血清性激素及子宮內(nèi)膜下層α亞型雌激素受體(ERα)免疫組化表達(dá)等指標(biāo)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,各染毒組的動(dòng)情周期均發(fā)生變化,體重、子宮系數(shù)、血清性激素水平及子宮內(nèi)膜下層ERα表達(dá)降低(P<0.05);BPA組及Cd組的 卵巢T-SOD及MDA水平與對(duì)照組比較無差異(P>0.05),但聯(lián)合組的卵巢T-SOD及MDA水平顯著區(qū)別于對(duì)照組(P<0.05);此外,聯(lián)合組的子宮內(nèi)膜下層ERα陽性表達(dá)率(36%±11.7%)顯著低于BPA組及Cd組(P<0.05)。BPA及Cd對(duì)雌性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)聯(lián)合作用毒性較各單劑量組增加,氧化損傷及影響ERα表達(dá)可能是聯(lián)合毒性作用機(jī)制之一。

        雙酚A; 鎘; 聯(lián)合作用; 雌性; 生殖內(nèi)分泌

        環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)是指能進(jìn)入機(jī)體并干擾機(jī)體內(nèi)分泌作用的環(huán)境污染物,其可通過結(jié)合雌激素受體的方式模擬雌激素樣作用,也被稱為環(huán)境雌激素[1]。雙酚A(bisphenol A, BPA)和重金屬鎘(cadmium, Cd)是兩種常見的EEDs,對(duì)人體健康造成多系統(tǒng)毒性。由于女性生殖內(nèi)分泌關(guān)系到下一代的健康,BPA與Cd的雌性生殖內(nèi)分泌毒性具有特殊的毒理學(xué)意義,已經(jīng)逐漸引起了環(huán)境學(xué)家及毒理學(xué)家的重視,已有大量研究表明了BPA與Cd均具有雌性生殖內(nèi)分泌毒性作用[2-3]。環(huán)境中的BPA及Cd可通過多種途徑復(fù)合污染食品,隨攝食共同進(jìn)入人體,產(chǎn)生聯(lián)合毒性[4],因此,BPA與Cd對(duì)女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的聯(lián)合毒性具有很強(qiáng)的理論價(jià)值及現(xiàn)實(shí)意義,但到目前為止,尚未有關(guān)于此方面的報(bào)道。本研究采用亞慢性毒性實(shí)驗(yàn),對(duì)未成年雌性小鼠展開BAP與Cd雌性生殖內(nèi)分泌聯(lián)合毒性研究,為改善生態(tài)環(huán)境及保護(hù)人群健康提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法(Materials and method)

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        3周齡雌性SPF級(jí)昆明小鼠40只,體重(10~14) g,由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2007-004。動(dòng)物房溫度控制在(23±2)℃,相對(duì)濕度為(40~70)%,12h/12h明暗周期,自由飲水,攝食。

        1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

        BPA,純度≥95%,由天津大茂化學(xué)試劑廠;CdCl2·2.5H2O,天津阿法埃莎化學(xué)有限公司;E2,孕酮P放免試劑盒,(天津九鼎生物技術(shù)公司);超氧化物歧化酶活性(SOD),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所), ERα兔單克隆抗體;羊抗兔SABC免疫組化試劑盒(天津明川生物公司);考馬斯亮藍(lán)G250(sigma公司);722型可見光分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);全自動(dòng)γ放射免疫計(jì)數(shù)儀(海核所日環(huán)光電儀器有限公司);1X51型倒置相差熒光顯微鏡及拍照系統(tǒng)(日本Olympus)。

        1.3 動(dòng)物分組與染毒

        小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,按體重分層隨機(jī)分為四組:對(duì)照組、BPA組(1.5 mg·Kg-1)、Cd組(1.25 mg·Kg-1,Cd2+計(jì)),BPA+Cd組(BPA1.5 mg·Kg-1+Cd2+1.25 mg·Kg-1),采用灌胃方式進(jìn)行染毒,每天一次,連續(xù)5周。以0.5% CMC-Na 為溶劑配置Cd溶液及BPA均勻混懸液,現(xiàn)用現(xiàn)配,對(duì)照組給予溶劑灌胃。

        1.4 指標(biāo)的檢測

        1.4.1 性成熟過程觀察

        觀察動(dòng)情周期:染毒周期結(jié)束后,于每天早晚7:00采用陰道脫落細(xì)胞涂片法觀察并記錄小鼠動(dòng)情周期變化,觀察期限為5 d[5]。由于陰道脫落細(xì)胞圖片判斷動(dòng)情后期及動(dòng)情間期區(qū)別不明顯,本次合并計(jì)算動(dòng)情后期及動(dòng)情間期時(shí)間。

        1.4.2 體重及臟器系數(shù)

        染毒結(jié)束后,于動(dòng)情間期或動(dòng)情后期稱重(處死體重),乙醚麻醉,摳眼球取血,頸椎脫臼處死。取肝臟、卵巢及子宮,稱重,計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器重/處死體重。

        1.4.3 卵巢激素水平的檢測

        采用放射免疫方法測定血清中E2及P的含量,采用九鼎生物技術(shù)公司(天津)放免試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒操作規(guī)程操作。E2加標(biāo)回收率為98%;P加標(biāo)回收率96%。

        1.4.4 卵巢抗氧化指標(biāo)

        SOD采用黃嘌呤氧化酶法,MDA采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(TBA),卵巢組織蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法。采用南京建成試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行操作。

        1.4.5 子宮組織ER表達(dá)

        將子宮置于4%中性多聚甲醛固定液中,脫水,透明,石蠟包埋,行5m切片。60℃烤片2 h后按照免疫組化試劑盒規(guī)程進(jìn)行染色,拍照,采用IMAGE-PRO PLUS5.0圖像分析軟件觀察子宮組織內(nèi)膜下層細(xì)胞ERα表達(dá)情況,以細(xì)胞核/細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為ERα陽性表達(dá)。每張切片至少觀察5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)算200個(gè)細(xì)胞。

        ERα陽性表達(dá)率=ERα陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)細(xì)胞總數(shù)。

        1.5 統(tǒng)計(jì)方法

        2 結(jié)果(Results)

        2.1 染毒一般情況觀察

        染毒后期,各染毒組小鼠活動(dòng)明顯減少,攝食減少,以聯(lián)合染毒組小鼠明顯。解剖發(fā)現(xiàn)各染毒組小鼠腹腔內(nèi)有不同程度的非血性滲出液,未見臟器及卵巢有明顯病理學(xué)改變。

        對(duì)小鼠的性成熟過程觀察發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,Cd組及聯(lián)合組的動(dòng)情周期時(shí)間顯著延長(P<0.05);各組動(dòng)情前期時(shí)間無差異(P>0.05);各染毒組的動(dòng)情期縮短,動(dòng)情后期及間期時(shí)間延長(P<0.05),見表1。

        2.2 小鼠體重及臟器系數(shù)

        與對(duì)照組比較,Cd組的處死體重及子宮系數(shù)顯著降低(P<0.05),聯(lián)合組的處死體重、肝臟系數(shù)顯著降低(P<0.05);聯(lián)合組的處死體重顯著低于BPA組及Cd組(P<0.05);各組的卵巢系數(shù)無差異(P<0.05),見表2。

        2.3 小鼠血清卵巢激素水平及抗氧化水平

        與對(duì)照組比較,BPA組的卵巢T-SOD、MDA水平、血清E2及P等指標(biāo)無顯著性差異;Cd組血清E2水平降低;聯(lián)合組的卵巢T-SOD活力降低,卵巢MDA含量增高,血清E2水平降低(P<0.05)。各組血清孕酮水平無顯著性差異(P<0.05),見表3

        表1 BPA和Cd聯(lián)合染毒對(duì)幼年雌性小鼠性成熟過程影響±S, n=10)

        注: 肩注不同字母表示P<0.05。

        Note: Shoulder note by the different letters indicate P<0.05.

        表2 BPA和Cd聯(lián)合染毒對(duì)幼年雌性小鼠體重及臟器系數(shù)影響±S, n=10)

        注: 肩注不同字母表示P<0.05。

        Note: Shoulder note by the different letters indicate P<0.05.

        表3 卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

        注: 肩注不同字母表示P<0.05。

        Note: Shoulder note by the different letters indicate P< 0.05

        2.4 小鼠子宮內(nèi)膜下層雌激素受體表達(dá)

        如圖1所示,與對(duì)照組比較,各染毒組的子宮內(nèi)膜下細(xì)胞ERα表達(dá)降低。對(duì)照組、BPA組、Cd組子宮內(nèi)膜下層細(xì)胞陽性表達(dá)率分別為(73.80±5.39)%,(65.00±7.75)%,(60.20±12.48)%,(36.00±11.70)%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,Cd組及聯(lián)合組的ERα表達(dá)顯著低于對(duì)照組,聯(lián)合組的ERα表達(dá)顯著低于Cd組及BPA組(P<0.05)。

        如圖2所示,ERα表達(dá)的陽性細(xì)胞顯示為褐色或棕黃色,而ERα陰性的細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色后顯為藍(lán)色。在子宮組織中,子宮上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和平滑肌肌細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá),對(duì)照組的ERα陽性表達(dá)細(xì)胞較多,BPA組及Cd組次之,而聯(lián)合組的ER表達(dá)最少,明顯弱于其它各組;未能發(fā)現(xiàn)各劑量組ERα在子宮組織中各類細(xì)胞的分布有顯著變化。

        3 討論(Discussion)

        BPA學(xué)名為2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷,被廣泛的應(yīng)用于塑料制品等工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)中,可通過食品包裝材料直接或間接地污染食品。而Cd是人體接觸最多的重金屬,廣泛的分布在環(huán)境介質(zhì)中,可由食品加工過程的污染進(jìn)入到食品中。調(diào)查發(fā)現(xiàn),中國受Cd污染的區(qū)域大部分處于工業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū),這些區(qū)域不可避免的同時(shí)受到BPA和Cd的污染[6]。因此,BPA和Cd可能通過食品介質(zhì)對(duì)人體產(chǎn)生聯(lián)合毒性。

        圖1 BPA和Cd聯(lián)合染毒對(duì)幼年雌性小鼠子宮內(nèi)膜下層ERα表達(dá)率的影響注:a表示與對(duì)照組比較P<0.05;b表示與聯(lián)合組比較,P<0.05。Fig. 1 Effect on ER expression in endometrial of young female mice treated with BPA and Cd combined exposureNote: a means P<0.05 compared with control group;b means P<0.05 compared with combination group

        圖2 雌性小鼠子宮內(nèi)膜下層ERα表達(dá)免疫組化圖注:A 對(duì)照組;B BPA組;C Cd組;D BPA+Cd組(×400)Fig. 2 ER immunohistochemistry figure of endometrium in female miceNote: A Control group; B BPA group; C Cd group; D BPA+Cd group (×400)

        但由于目前的認(rèn)識(shí)水平和研究方法的限制,對(duì)于BPA和Cd聯(lián)合作用的了解尚不夠充分,本研究對(duì)BPA和Cd雌性生殖內(nèi)分泌毒性聯(lián)合作用進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明,BPA和Cd聯(lián)合染毒后,可破壞卵巢組織性激素分泌功能,能協(xié)同降低卵巢組織的抗氧化能力及抑制子宮組織中ERα的表達(dá)。

        目前,化學(xué)物聯(lián)合毒性可分為協(xié)同、獨(dú)立、拮抗、允許等多種形式,但其作用機(jī)制尚不清楚,可能與生物轉(zhuǎn)化、受體作用、物質(zhì)間的化學(xué)反應(yīng)功能疊加或拮抗有關(guān)[7]。當(dāng)兩種化學(xué)物作用于同一靶器官且有相同的毒性作用時(shí),可通過多種機(jī)制對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響,從而產(chǎn)生聯(lián)合毒性。國內(nèi)外研究表明, BPA和Cd都能作用于卵巢, 并產(chǎn)生某些相同的毒性作用,如BPA可以增加未成年大鼠閉鎖卵泡比例,抑制卵巢發(fā)育[8],改變血清中E2及P的水平[9]。而Cd能在卵巢蓄積,促進(jìn)卵泡閉鎖[10],促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡[11],降低卵巢分泌雌、孕激素分泌[12],但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),BPA與Cd聯(lián)合染毒并沒有對(duì)卵巢組織分泌E2及P功能產(chǎn)生協(xié)同作用,推測可能與BPA及Cd影響E2及P的作用機(jī)制不同有關(guān),有待于進(jìn)一步研究。此外,已有研究表明, Cd與BPA都能對(duì)包括卵巢在內(nèi)的多個(gè)生殖組織器官產(chǎn)生氧化損傷[13-14],本研究發(fā)現(xiàn),在本次實(shí)驗(yàn)劑量條件下,BPA及Cd單獨(dú)染毒未影響卵巢組織的抗氧化能力,但聯(lián)合染毒后顯著增加了小鼠卵巢組織氧化損傷,表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。

        激素器官對(duì)激素的反應(yīng)不僅取決于機(jī)體激素濃度,也取決于激素靶器官中受體的含量,因此,兩種化學(xué)物還可通過受體的相互作用而產(chǎn)生聯(lián)合協(xié)同作用。子宮是雌激素的主要靶器官,其生理功能的調(diào)節(jié)依賴于雌激素和ER的相互作用,ER丟失可導(dǎo)致子宮組織細(xì)胞中的雌激素靶基因?qū)Υ萍に氐姆磻?yīng)性,從而影響雌性機(jī)體的生殖功能。ER在哺乳動(dòng)物子宮中有ERα和ERβ兩種亞型,其中ERα表達(dá)占優(yōu)勢,在子宮生理功能的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用,而ERβ表達(dá)微弱,其生理功能尚不清楚。較多的國內(nèi)外研究表明,BPA與Cd都能與雌性生殖組織中的ER相互作用,如可以模擬雌激素與ER結(jié)合,調(diào)節(jié)ER表達(dá)及影響內(nèi)源性E2與ER的親和力[15-16]。本次實(shí)驗(yàn)劑量條件下, Cd降低了子宮組織所有類型細(xì)胞,包括上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中ERα表達(dá), BPA對(duì)ERα表達(dá)無影響,而BPA與Cd聯(lián)合染毒后, ERα表達(dá)顯著低于單獨(dú)染毒組,說明BPA及Cd對(duì)子宮組織各類型細(xì)胞ERα表達(dá)的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng),而對(duì)ER親和力的影響是否具有協(xié)同效應(yīng)需進(jìn)一步探索。

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        Liu Z P, Zhang X P, Zhang W Z, et al. Effects of lactational exposure to combination of soy isoflavones and bisphenol A on estrogen receptors in neonate female rats [J]. Chinese Journal of Food Hygiene, 2008, 20(6): 510-513 (in Chinese)

        Collective Effect of BPA and Cd at the Subchronically Level on Reproductive Endocrine in Immaturate Female Mice

        He Qingfeng1,*, Li Hong2, Li Yanjie3, Zhang Pingping1, Zhang Ailin1, Wu Haiqing1

        1. Food Science and Biotechnology Department in Tianjin Agriculture College, Tianjin 300384, China 2. Pharmacy Department in Fujian Health College, Fuzhou 350101, China 3. Computer and Information Engineering Department in Tianjin Agriculture College, Tianjin 300384, China

        Received 23 May 2014 accepted 20 August 2014

        There are a lot of research about endocrine disrupting toxicity of bisphenol A (BPA) or cadmium(Cd), but no studies have been carried out to shed light on combined toxicity of BPA and Cd. Forty Kunming female juvenile mice were randomly divided into 4 groups(normal control,BPA,Cd,and BPA plus Cd group). The mice were treated by gavage for 5 successive weeks. By the end of the experiment, the estrus cycle, antioxidant activity of ovary, serum sex hormone levels and estrogen receptor-alpha(ERα) expression in endometrium of mice were detected. Compared with control group,there are difference on time of estrus, body weight, uterus coefficient, serum E2 levels and endometrium ERαexpression in treated groups; Ovary T-SOD activity and MDA levels were no signifficantly different in BAP group and Cd group compared to the control group (P>0.05), however, ovary T-SOD activity and MDA levels in collective group were significantly different compared with those of the control group (P<0.05). Furthermore, endometrium ERαexpression (36±11.7)% in collective group were lower than those of single-dose groups (P<0.05). Combined effect of BPA and Cd is more toxic than that of single dose exposure, impact on ERαexpression and oxidative damage may be the mechanisms of the combined toxicological effect.

        bisphenol A; cadmium; combined effect; female; reproductive endocrinology

        天津農(nóng)學(xué)院教學(xué)改革項(xiàng)目(12-A2-03)

        何慶峰(1979-),男,講師,碩士,食品毒理方向,E-mail: hqf42109510@163.com

        10.7524/AJE.1673-5897-20140523002

        2014-05-23 錄用日期:2014-08-20

        1673-5897(2015)3-129-06

        X171.5

        A

        何慶峰,李宏,李燕杰, 等. 雙酚A聯(lián)合鎘亞慢性染毒對(duì)未成年雌性小鼠生殖內(nèi)分泌干擾作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2015, 10(3): 129-134

        He Q F, Li H, Li Y J, et al. Collective effect of BPA and Cd at the subchronically level on reproductive endocrine in immaturate female mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 129-134 (in Chinese)

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