薛利劍，劉曉蕙，楊明峰，劉 迎，朱 靖，喬 豆，莊東剛，崔留欣，張慧珍,*

1. 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，鄭州 450001 2. 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046

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微囊藻毒素-LR通過線粒體途徑誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞凋亡

薛利劍1，劉曉蕙2，楊明峰1，劉 迎1，朱 靖1，喬 豆1，莊東剛1，崔留欣1，張慧珍1,*

1. 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，鄭州 450001 2. 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046

探討線粒體Caspase依賴性途徑是否參與微囊藻毒素-LR (microcystin-LR, MC-LR)誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells, 16HBE)凋亡過程。將處于對數(shù)生長期的16HBE分別暴露于終濃度為0(對照組)、2.5、5、10 μg·mL-1的微囊藻毒素-LR和10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK，持續(xù)24 h和48 h。檢測細(xì)胞凋亡率，線粒體跨膜電位(ΔΨm)，Caspase-3和Caspase-9相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對照組相比，各濃度染毒組細(xì)胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9相對表達(dá)量均升高，10 μg·mL-1MC-LR染毒組線粒體膜電位降低；與10 μg·mL-1MC-LR組相比，10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK組細(xì)胞凋亡率明顯降低，Caspase-3和Caspase-9相對表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且隨著MC-LR染毒濃度的升高或染毒時間的延長，16HBE細(xì)胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9相對表達(dá)量呈升高趨勢。研究表明，MC-LR可以通過線粒體Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡。

微囊藻毒素-LR；線粒體途徑；人支氣管上皮細(xì)胞；凋亡

微囊藻毒素(microcystins, MCs)是藍(lán)藻生長過程中釋放的代謝產(chǎn)物，是一組具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，由水體中的藍(lán)藻如銅綠微囊藻等產(chǎn)生，是對人類及動物健康威脅最大的一種細(xì)胞內(nèi)毒素。目前檢測到90余種微囊藻毒素的異構(gòu)體，其中微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)是最常見，也是毒性最強的一種藻毒素[1]。2006年，MC-LR被國際癌癥研究組織列為對人類可能致癌物，有可能是一種促癌劑。研究發(fā)現(xiàn)MC-LR可能的促肝癌機制是其能與蛋白磷酸酶PPl、PP2A的催化亞單位結(jié)合，抑制二者的活性，導(dǎo)致MAPK過度激活，使調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的基因平衡失調(diào)，細(xì)胞生長失控，導(dǎo)致肝癌發(fā)生。也有報道稱，MC-LR可通過誘導(dǎo)細(xì)胞c-fos、c-jun異常表達(dá)以及細(xì)胞周期的調(diào)控失衡，從而促進癌癥的發(fā)生[2]。

目前對MCs研究較多的是其對肝、腎、淋巴細(xì)胞以及生殖細(xì)胞等的凋亡毒性作用以及機制探索[3-4]，對呼吸系統(tǒng)的影響研究較少，然而二十世紀(jì)以來，在許多國家和地區(qū)均有發(fā)生產(chǎn)毒藻類引起人類呼吸系統(tǒng)中毒的事件[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)MCs可能會因水體泡沫和娛樂過程中產(chǎn)生的浪花等通過肺部呼吸進入到人體，從而引起呼吸系統(tǒng)疾病[7]。MC-LR能刺激肺泡吞噬細(xì)胞釋放炎性因子[8]；破壞小鼠肺實質(zhì)，引起肺間質(zhì)性水腫以及炎性細(xì)胞的聚集，但并未抑制肺組織內(nèi)蛋白磷酸酶PPl、PP2A的活性[9]。現(xiàn)已有報道都是關(guān)于MCs對呼吸系統(tǒng)的損傷，尚缺乏對其具體作用機制的研究。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，在維持多細(xì)胞生物體內(nèi)平衡，免疫力以及預(yù)防癌癥中起著關(guān)鍵作用。線粒體在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。通過線粒體途徑執(zhí)行細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，如線粒體膜通透性增加，膜電位降低，其中在細(xì)胞凋亡中起作用的凋亡促進蛋白細(xì)胞色素C(cytochrome-c, Cyt-c)從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，Cyt-c的釋放會刺激凋亡小體復(fù)合物的形成，然后通過切割裂解導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的激活，接著導(dǎo)致效應(yīng)凋亡蛋白酶例如Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7的激活。Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7的激活會執(zhí)行靶細(xì)胞凋亡的最后階段[10]。

因此，本研究測定細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位以及Caspase-3和Caspase-9各指標(biāo)的變化，觀察MC-LR對人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells, 16HBE)的凋亡作用，并且測定加入Caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK后Caspase-3, Caspase-9以及細(xì)胞凋亡率的變化，從而探討線粒體Caspase依賴性途徑是否參與MC-LR誘導(dǎo) 16HBE細(xì)胞凋亡過程。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細(xì)胞及受試物

16HBE獲贈于紐約血液中心(New York Blood Center)安秀麗教授。MC-LR(純度≥95%)購自北京伊普瑞斯科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。線粒體膜電位檢測試劑盒和Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(20 mmol·L-1)購自碧云天生物技術(shù)研究所。凋亡檢測試劑盒和兔抗Caspase-3，Caspase-9，β-actin多克隆抗體及辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 器材

WJ-Ⅱ細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Revco公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。DYCZ-24DN型垂直電泳儀，DYCZ-40D型濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)電泳槽及WD-9405B型水平搖床購自北京六一儀器廠。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

從-80°C冰箱中取出保存的16HBE細(xì)胞凍存管，迅速放入37 °C熱水中，快速將凍存液融化后，然后加入10倍體積37 °C預(yù)熱含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37°C、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時傳代。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 細(xì)胞凋亡率的測定( Annexin V/PI雙染法)

取處于對數(shù)生長期終密度為1×105個·mL-1的16HBE細(xì)胞懸浮液，以每孔1 mL細(xì)胞懸浮液接種于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，設(shè)置0 μg·mL-1MC-LR對照組和2.5、5、10 μg·mL-1MC-LR以及10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK實驗組，每組3個平行樣，放入孵育箱中分別培養(yǎng)24 h，48 h。染毒結(jié)束后，去除原液，緩沖液沖洗2次，加入胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，Binding Buffer重懸細(xì)胞，混勻，分別加入10 μL FITC和10 μL PI，輕輕混勻，避光反應(yīng)15 min，流式檢測。本實驗重復(fù)3次。

1.5.2 細(xì)胞線粒體膜電位的測定(JC-1法)

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，消化傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個·mL-1置于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，設(shè)置10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液的陰性對照組和終濃度分別為2.5、5、10 μg·mL-1MC-LR溶液的實驗組，每個處理組3個平行樣。各組分別培養(yǎng)24 h和48 h。去除各組原液，緩沖液沖洗2次，加入胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入JC-1染色工作液培養(yǎng)箱中孵育25 min，4 °C，2 000 r離心收集細(xì)胞，最后加入JC-1染色緩沖液(1X)懸浮細(xì)胞，30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各樣本紅、綠熒光強度比，檢測JC-1單聚體時的激發(fā)光設(shè)置490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm，檢測JC-1聚合物時，激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。本實驗重復(fù)3次。

1.5.3 細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)量的測定 (Western blot法)

不同濃度MC-LR及聯(lián)合Caspase抑制劑染毒結(jié)束后，收集細(xì)胞到離心管中，各組離心管中加入蛋白裂解液200 μL，震蕩混勻，冰上裂解30 min，用槍頭反復(fù)吹打保證細(xì)胞充分裂解。然后4 °C，12 000 r·min-1，離心5 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，分裝，-80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制12%分離膠和5%濃縮膠，蛋白變性后上樣恒壓電泳(濃縮膠：80 v，30min；分離膠：120 v，10min。根據(jù)預(yù)染marker標(biāo)記的位置將目的蛋白切下，濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。室溫下孵育一抗，一抗稀釋濃度： Caspase-3 (1:200)和Caspase-9(1:200)。TBST漂洗15 min，重復(fù)3次。二抗(1:5 000)孵育1 h，TBST漂洗15 min，重復(fù)3次。ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影及定影。Image Quant 300 成像系統(tǒng)處理蛋白條帶圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

MC-LR濃度MC-LRconcentration凋亡率(%)Apoptosisrate(%)24h 48h tP0μg·mL-10．800±0．2652．200±0．300#6．0620．0042．5μg·mL-16．033±0．024?19．400±2．107?#10．1890．0015μg·mL-114．233±2．103?23．800±0．900?#7．2430．00210μg·mL-126．100±1．609?32．233±1．358?#5．0450．00710μg·mL-1+7．367±1．041a9．500±1．082aF186．848267．226P<0．001<0．001

注：*表示與對照(0 μg·mL-1)組相比，P<0.05。#表示同一MC-LR濃度下，與24 h組相比，P<0.05；a表示同一作用時間下，與10 μg·mL-1MC-LR組相比，P<0.05；10+表示10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK組。

Note: *P<0.05, compared with the control group(0 μg·mL-1).#P<0.05, compared with the 24 h at the same concentration of MC-LR. a representing P<0.05, compared with the 10 μg·mL-1at the same time of exposure. 10+representing 10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK group.

圖1 不同濃度MC-LR對16HBE細(xì)胞凋亡的影響注：A: 0 μg·mL-1MC-LR(24h) B: 2.5 μg·mL-1MC-LR(24h) C: 5 μg·mL-1MC-LR(24h) D: 10 μg·mL-1MC-LR(24h)E: 0 μg·mL-1MC-LR(48h) F: 2.5 μg·mL-1MC-LR(48h) G: 5 μg·mL-1MC-LR(48h) H: 10 μg·mL-1MC-LR(48h)P: 10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK(24h) O: 10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK(48h)。Fig. 1 Effect of MC-LR on apoptosis of 16HBE cellsNote: A: 0 μg·mL-1MC-LR (24h) B: 2.5 μg·mL-1MC-LR(24h) C: 5 μg·mL-1MC-LR(24h) D: 10 μg·mL-1MC-LR(24h)E: 0 μg·mL-1MC-LR (48h) F: 2.5 μg·mL-1MC-LR(48h) G: 5 μg·mL-1MC-LR(48h) H: 10 μg·mL-1MC-LR(48h)P: 10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK(24h) O: 10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK(48h).

2 結(jié)果(Results)

2.1 MC-LR對16HBE細(xì)胞凋亡的影響

流式檢測不同濃度MC-LR對16HBE細(xì)胞凋亡率的影響見表1、圖1。當(dāng)暴露時間一定時，隨著MC-LR暴露濃度的增加，16HBE細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢；當(dāng)MC-LR暴露濃度一定時，隨著暴露時間的增加，16HBE細(xì)胞凋亡率升高。當(dāng)MC-LR濃度為10 μg·mL-1時，加Z-VAD-FMK組與不加組相比，細(xì)胞凋亡率明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 MC-LR對細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1法檢測不同濃度MC-LR對16HBE細(xì)胞線粒體膜電位的影響見表2。當(dāng)MC-LR作用細(xì)胞時間一定，MC-LR暴露濃度為10 μg·mL-1時，與對照組相比，線粒體膜電位明顯降低，并有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MC-LR暴露濃度分別為2.5、5 μg·mL-1時，線粒體膜電位的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)MC-LR濃度為10 μg·mL-1時，48 h組與24 h組相比，16HBE細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 MC-LR對細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

MC-LR作用于16HBE細(xì)胞24 h和48 h后, 細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9各蛋白相對表達(dá)量見表3、圖2。16HBE細(xì)胞暴露于MC-LR 24 h后，2.5、5、10 μg·mL-1MC-LR劑量組Caspase-3，Caspase-9蛋白相對表達(dá)量與對照組相比升高，并且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 MC-LR作用16HBE細(xì)胞48 h后，各蛋白相對表達(dá)量的變化趨勢與MC-LR作用24 h基本一致。當(dāng)16HBE細(xì)胞暴露于相同MC-LR濃度時， 48 h組與24 h組相比，Caspase-3和Caspase-9蛋白相對表達(dá)量增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)MC-LR濃度為10 μg·mL-1時，加Caspase抑制劑Z-VAD-FMK組與不加抑制劑組相比，Caspase-3和Caspase-9蛋白相對表達(dá)量降低，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：*表示與對照(0 μg·mL-1)組相比，P<0.05。#表示10 μg·mL-1MC-LR 組24 h 與48 h相比，P<0.05。Note: *P<0.05, compared with the control group(0 μg·mL-1). #P<0.05, 10 μg·mL-1MC-LR group (24 h) compared with the 10 μg·mL-1MC-LR group (48 h).

表3 不同濃度 MC-LR對細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9相對表達(dá)量的影響

注：*表示與對照(0 μg·mL-1)組相比，P<0.05。#表示同一MC-LR濃度下，與24 h組相比，P<0.05；a表示同一作用時間下，與10 μg·mL-1MC-LR組相比，P<0.05；10+表示10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK組。

Note:*P<0.05, compared with the control group(0 μg·mL-1).#P<0.05, compared with the 24 h at the same concentration of MC-LR. a representing P<0.05, compared with the control group (10 μg·mL-1) at the same time of exposure. 10+representing 10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK group.

圖2 MC-LR對16HBE細(xì)胞中caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的影響注：+表示加入Caspase抑制劑Z-VAD-FMK (50 μmol·L-1)。Fig. 2 Effect of MC-LR on protein expression levels ofCaspase-3 and Caspase-9Note: + representing 10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK

3 討論(Discussion)

支氣管上皮細(xì)胞的增殖以及損傷是肺組織修復(fù)、再生、肺纖維化和致癌作用的關(guān)鍵。當(dāng)支氣管上皮細(xì)胞受到不良因素刺激時，可以引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，進一步引起基因的損傷、激活原癌基因或者抑制腫瘤抑制基因，以及引起凋亡調(diào)節(jié)基因的變化，進而引起支氣管上皮細(xì)胞的癌變轉(zhuǎn)化[11]。近半世紀(jì)以來，許多國家和地區(qū)肺癌的發(fā)病率和死亡率均大幅度的增加，已經(jīng)發(fā)展成為死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康和生命。肺癌的發(fā)病是一個多因素、多階段的過程，是各種因素復(fù)雜交互作用的結(jié)果。雖然吸煙是肺癌發(fā)病的最主要危險原因，卻無法解釋很多肺癌患者并不吸煙的這一流行病學(xué)現(xiàn)象，因此環(huán)境因素與肺癌發(fā)生的相關(guān)研究已成為近年來肺癌分子流行病學(xué)熱點[12]。

目前，被廣泛認(rèn)知的細(xì)胞兩大凋亡途徑包括：線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部途徑和死亡受體介導(dǎo)的外部途徑[13]。實驗證明線粒體介導(dǎo)的凋亡是細(xì)胞凋亡的主要途徑，它的主要分子生物學(xué)基礎(chǔ)是線粒體膜結(jié)構(gòu)表面的通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondria permeability transition pore，MPTP)的開放，MPTP持續(xù)性的非特異性開放會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生致死性結(jié)果，如跨膜電位消失、基質(zhì)的Ca2+外流、超氧離子的產(chǎn)生，并且會釋放一些膜蛋白成分等[14]。研究表明，線粒體膜電位下降，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成線粒體損傷，促使細(xì)胞色素C等大量的相關(guān)凋亡分子從線粒體中釋放，從而引發(fā)細(xì)胞執(zhí)行凋亡程序[15]。細(xì)胞色素C釋放刺激凋亡小體復(fù)合物形成，然后通過切割裂解導(dǎo)致Caspase-9的激活，接著導(dǎo)致效應(yīng)凋亡蛋白酶Caspase-3的激活，從而執(zhí)行靶細(xì)胞凋亡這一途徑被稱為線粒體依賴性凋亡途徑。Zhang等[16]的研究表明MC-LR能誘導(dǎo)黑斑蛙肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，細(xì)胞色素c釋放，Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)量增加，MC-LR可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡；也有研究表明MC-LR在不同類型細(xì)胞中都能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，以及激活Caspase-3，Caspase-9的反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡作用[17]。

本實驗中，當(dāng)16HBE細(xì)胞經(jīng)MC-LR分別暴露24 h和48 h之后，細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位以及Caspase-3和Caspase-9相對表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示，隨著MC-LR染毒濃度的升高，線粒體膜電位呈下降趨勢，Caspase-3和Caspase-9的相對表達(dá)量呈升高趨勢，同時細(xì)胞凋亡率也呈現(xiàn)升高趨勢，具有劑量依存關(guān)系；在相同濃度染毒組，48 h組和24 h組相比，線粒體膜電位呈下降趨勢，Caspase-3和Caspase-9的相對表達(dá)量以及細(xì)胞凋亡率呈升高趨勢。說明MC-LR暴露16HBE細(xì)胞可導(dǎo)致其線粒體膜電位丟失，造成線粒體功能損傷，促使凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9的激活，接著激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，進而誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生凋亡。說明線粒體參與了MC-LR誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡過程，并起著非常關(guān)鍵的作用，表明MC-LR可通過線粒體Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡。

此外，本研究中利用Caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK提前處理30 min后，發(fā)現(xiàn)暴露于10 μg·mL-1MC-LR+50 μmol·L-1Z-VAD-FMK組細(xì)胞與10 μg·mL-1MC-LR單獨作用組細(xì)胞相比，Caspase-3和Caspase-9相對表達(dá)量降低，細(xì)胞凋亡率明顯降低。說明Caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK一定程度上阻止MC-LR誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生凋亡，進一步證實MC-LR可通過線粒體Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡。

致謝：感謝河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郭紅祥老師在實驗設(shè)計和英文寫作上的幫助和支持。

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Apoptosis Induced by Microcystin-LR in Human Bronchial Epithelial Cell through Mitochondrial Pathway

Xue Lijian1, Liu Xiaohui2, Yang Mingfeng1, Liu Ying1, Zhu Jing1, Qiao Dou1, Zhuang Donggang1, Cui Liuxin1, Zhang Huizhen1,*

1. College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China 2. School of Basic Medicine, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

Received 14 May 2014 accepted 26 August 2014

To verify that mitochondrial Caspase-dependent pathway is involved in apoptosis in human bronchial epithelial cells induced by microcystin-LR (MC-LR), the logarithmic phase 16HBE cells were exposed to final concentrations of 0(control group), 2.5, 5, 10 μg·mL-1MC-LR, as well as 10 μg·mL-1MC-LR and 50 μmol·L-1Z-VAD-FMK (a broad-spectrum Caspase inhibitor) for 24 h or 48 h in vitro. The apoptosis rate, mitochondrial membrane potential (ΔΨm), and the expression of Caspase-3 and Caspase-9 were detected. Compared with the control group, the apoptosis rate, the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 increased significantly (P<0.05) in the treatment groups, and the ΔΨm decreased markedly (P<0.05) in the group treated with 10 μg·mL-1MC-LR. The apoptosis rate, the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 in the group treated with both 10 μg·mL-1MC-LR and 50 μmol·L-1Z-VAD-FMK were lower than that in the group treated only with the 10 μg·mL-1MC-LR. In addition, the apoptosis rates, the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 had a positive correlation with MC-LR concentrations and treatment time. These results suggested that MC-LR can induce 16HBE cells apoptosis through the mitochondrial Caspase-dependent pathway.

microcystin-LR; mitochondrial pathway; human bronchial epithelial cell; apoptosis

國家自然科學(xué)基金(81472948)；河南省科技攻關(guān)計劃(142102310344)；河南省科技發(fā)展計劃(132102310051)；河南省科技重點攻關(guān)項目(122102310208)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃(2011GGJS-012)

薛利劍(1989-)，男，碩士研究生，從事環(huán)境醫(yī)學(xué)與毒理學(xué)研究。E-mail: 18339919221@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: huizhen18@126.com

10.7524/AJE.1673-5897-20140514001

2014-05-14 錄用日期：2014-08-26

1673-5897(2015)3-123-06

X171.5

A

張慧珍(1972-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要研究方向為環(huán)境醫(yī)學(xué)與毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。

薛利劍，劉曉蕙，楊明峰, 等. 微囊藻毒素-LR通過線粒體途徑誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞凋亡[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2015, 10(3): 123-128

Xue L J, Liu X H, Yang M F, et al. Apoptosis induced by microcystin-LR in human bronchial epithelial cell through mitochondrial pathway [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 123-128 (in Chinese)