吳添舒，唐萌

東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，南京 210009

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熒光量子點在神經(jīng)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用及前景

吳添舒，唐萌*

東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，南京 210009

如今納米生物技術(shù)的研究正以迅猛的勢頭不斷發(fā)展。量子點作為一種新型的納米熒光探針，由于其優(yōu)越的光電學(xué)特性在生物學(xué)和毒理學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。神經(jīng)毒理學(xué)作為毒理學(xué)的一個重要分支，量子點的應(yīng)用也給該領(lǐng)域帶來了技術(shù)上的革命。本文重點闡述了量子點作為一種新型單分子技術(shù)和一種優(yōu)秀的熒光探針在神經(jīng)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用。同時，作者還簡要介紹了量子點進(jìn)入機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的途徑和影響其應(yīng)用的一些因素，為今后量子點的生物安全性研究和更好地應(yīng)用提供了有價值的參考。

納米技術(shù)；量子點；神經(jīng)毒理學(xué)；熒光探針；藥物轉(zhuǎn)運

隨著納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，“納米醫(yī)學(xué)”作為一個新興領(lǐng)域由此誕生。在納米技術(shù)中所研究的納米顆粒是指粒徑在1～100 nm范圍內(nèi)的物質(zhì)和材料，具有很多獨特的特性。隨著對納米藥物、載體及材料等研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)可將納米技術(shù)更多的應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)研究中。量子點作為一種新型的納米熒光探針，由于其在光學(xué)及電學(xué)上獨特的特性受到研究者的廣泛關(guān)注。雖然目前有關(guān)量子點在生物學(xué)基礎(chǔ)研究中應(yīng)用的研究報道很多，但在毒理學(xué)，特別是神經(jīng)毒理學(xué)領(lǐng)域的研究相對較少。以下將就量子點在神經(jīng)毒理學(xué)中的應(yīng)用及其前景進(jìn)行綜述。

1 量子點及其在生物學(xué)中的應(yīng)用

量子點(quantum dots，QDs)是一種由Ⅲ～Ⅴ族或Ⅱ～Ⅵ族元素組成的，粒徑小于或接近激子波爾半徑的半導(dǎo)體納米微晶體，典型的量子點直徑通常在1～10 nm[1]。量子點的結(jié)構(gòu)一般以一種半導(dǎo)體材料為內(nèi)核，外面包裹第二種半導(dǎo)體材料。通常內(nèi)核決定了量子點的光學(xué)特性，而外殼則加強(qiáng)了量子點的光穩(wěn)定性[2]。量子點的種類很多，每種量子點由于其材料、大小、形狀或結(jié)構(gòu)等的不同而表現(xiàn)出不同的光電學(xué)特性。目前應(yīng)用最廣泛的為內(nèi)核含鎘(Cd)和碲(Te)的量子點，因為它們的量子限制區(qū)域橫跨整個光譜[3]。此外，已經(jīng)報道的量子點種類還有InP量子點、PbS量子點、含硅量子點、CuInS2量子點、Ag2S量子點等[4-8]。由于本身材料特性，它們或有更強(qiáng)的光學(xué)穩(wěn)定性，或有更低的毒性，或有更好的水分散性，從而能適應(yīng)不同的應(yīng)用需求。

大約三十年前，量子點首次被發(fā)現(xiàn)，由于其獨特的半導(dǎo)體和冷光特性，僅僅被應(yīng)用于電學(xué)領(lǐng)域。在本世紀(jì)初，隨著納米科技的不斷進(jìn)步，量子點優(yōu)異的光學(xué)特性使得其十分適合作為有效的能量供體用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析。FRET是一個很好的定量測量兩個發(fā)光基團(tuán)間的距離的方法，可以用于觀察蛋白構(gòu)象變化，監(jiān)控蛋白相互作用和酶活性。很多研究團(tuán)隊已經(jīng)將包被特定生物分子(通常為抗體)的量子點用于免疫檢測[9]。量子點也可用來追蹤細(xì)胞，檢測病原體和毒素[10,11]。近年來，量子點技術(shù)的發(fā)展在癌癥的診斷和治療上帶去了很大的影響。量子點可用于癌細(xì)胞定位，探測原發(fā)性癌癥及其轉(zhuǎn)移，識別目標(biāo)分子，協(xié)助治療[12,13]。

此外，生物共軛的量子點還可以靶向結(jié)合DNA或mRNA，雜交作為基因探針檢測相關(guān)基因。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光探針相比，量子點表現(xiàn)出更大的耐光性和信號強(qiáng)度。研究顯示量子點熒光探針已經(jīng)應(yīng)用于檢測乳腺癌相關(guān)基因ERBB2/HER2/神經(jīng)膜軌跡[14]。但是量子點產(chǎn)生熒光存在閃爍現(xiàn)象，使得信號穩(wěn)定性較差，另外，量子點表面包覆的寡核苷酸涂層會破壞其長期穩(wěn)定性，若這些缺點不能得到解決，量子點將失去相較于傳統(tǒng)有機(jī)熒光材料的優(yōu)越地位。

量子點在生物科學(xué)上的一項重要應(yīng)用為活體成像。由于用同一激發(fā)光源激發(fā)不同尺寸和組成的量子點可獲得從紅到藍(lán)的一系列不同顏色的光[15]，尤其是適當(dāng)組分和大小的量子點可發(fā)射近紅外波長(700～2,000 nm)的光譜，組織散射和吸收都較藍(lán)綠光低很多，從而能夠得到最大組織穿透深度的光學(xué)信號，對于體內(nèi)深組織，如血管或淋巴管的效果會十分理想[16]。應(yīng)用量子點可以在醫(yī)學(xué)上將活體內(nèi)的生物過程在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)行特征的顯示，有利于疾病的無創(chuàng)診斷，有助于制定更合適的治療方案。

與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光材料相比，量子點有其獨特的優(yōu)勢，包括：光輻射的大小依賴性，即納米粒子半導(dǎo)體核心的大小變化與光輻射波長之間的相關(guān)性，又稱為量子限域；發(fā)射高強(qiáng)度高亮度的光信號；光穩(wěn)定性強(qiáng)，與其他光學(xué)顯影劑相比有更長的時間周期；抗漂白能力強(qiáng)；不易被組織自身熒光掩蓋；經(jīng)修飾后生物相容性好等[16-18]。如果量子點的毒性可以得到控制，這些優(yōu)勢使得量子點同樣可以作為優(yōu)秀的熒光探針應(yīng)用于毒理學(xué)的研究中，在分子水平上實時監(jiān)測或可視化受試化學(xué)物對機(jī)體生物學(xué)過程的干擾以及造成的負(fù)面影響；例如在毒物代謝/效應(yīng)動力學(xué)的研究中，量子點可以幫助我們深入了解進(jìn)入機(jī)體的毒物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)過程，提供各主要器官中毒物沉積和排除情況的信息，明確不同毒物作用的靶器官。量子點的應(yīng)用可以將毒理學(xué)研究變得更加簡單有效，而作為毒理學(xué)的一個重要分支，量子點將在，或已經(jīng)在神經(jīng)毒理學(xué)研究中帶來了技術(shù)上的革新。

2 量子點在神經(jīng)毒理學(xué)中的應(yīng)用

2.1 量子點的暴露途徑

Hardman總結(jié)了量子點的三條暴露途徑：職業(yè)暴露，環(huán)境暴露和生物醫(yī)學(xué)暴露[19]。職業(yè)暴露是量子點的主要暴露途徑，其來源有氣溶膠吸入、意外事故、皮膚接觸和經(jīng)口攝入等。主要暴露人群為量子點生產(chǎn)車間工作者、工程師、研究人員等。通過環(huán)境暴露的量子點，由于環(huán)境介質(zhì)的存在，量子點暴露所造成的健康效應(yīng)要受到環(huán)境轉(zhuǎn)化，環(huán)境轉(zhuǎn)運和環(huán)境降解等的影響。生物醫(yī)學(xué)方面的暴露途徑則是隨著量子點在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來越多的應(yīng)用而逐漸受到研究者的關(guān)注。但是由于量子點還未被允許應(yīng)用人體，目前暴露的方法多是針對研究動物的，如腹腔、靜脈注射，灌胃，鼻腔滴注等，而主要暴露的高危人群為進(jìn)行動物試驗的實驗室研究人員。通過大量的體內(nèi)和體外實驗研究我們發(fā)現(xiàn)一定濃度的量子點可以降低細(xì)胞存活率和繁殖率，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，蓄積于實驗動物主要臟器內(nèi)造成氧化應(yīng)激和炎癥損傷，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，還可以影響相關(guān)基因和蛋白的正常表達(dá)[20]。

進(jìn)入機(jī)體的量子點，由于突出的尺寸效應(yīng)，可以很輕易地跨越血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因而，跨越血腦屏障是存在于循環(huán)系統(tǒng)中的量子點進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要途徑之一。除了血腦屏障途徑，已有研究證實，吸入的納米顆粒也可以通過嗅覺神經(jīng)通路進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并轉(zhuǎn)移沉積于不同的大腦區(qū)域[21]。根據(jù)此相似納米顆粒的研究結(jié)果可以推測，量子點也可能經(jīng)嗅神經(jīng)轉(zhuǎn)運進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

2.2 量子點作為神經(jīng)電動力學(xué)探針

近年來，神經(jīng)科學(xué)家一直致力于弄清分子水平上突觸重塑導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶的改變，雖然研究者已經(jīng)明確突觸傳遞的機(jī)制依賴于神經(jīng)遞質(zhì)受體的橫向運動，但是卻沒有有效的方法追蹤單個突觸膜受體的空間動力學(xué)。目前，越來越多的研究者將單量子點追蹤看做一種單分子技術(shù)，用于研究神經(jīng)電動力學(xué)。早在2003年，Dahan等[22]首次利用量子點標(biāo)記單個甘氨酸受體從而檢測其擴(kuò)散動力學(xué)。其后，2007年，De Koninck等[23]運用量子點追蹤突觸上谷氨酸的進(jìn)出來檢測單個突觸受體的神經(jīng)回路。該研究在突觸效應(yīng)機(jī)制研究方面的貢獻(xiàn)甚至可能影響我們對于學(xué)習(xí)與記憶分子基礎(chǔ)的理解。此外，Marshell等[24]研究報導(dǎo)了量子點可以作為熒光傳感器監(jiān)測神經(jīng)元細(xì)胞膜電壓，其不但有更優(yōu)秀的熒光性能，還可以彌補傳統(tǒng)熒光傳感器的缺點：無法協(xié)同監(jiān)測大量單個神經(jīng)元間的強(qiáng)化活動。

同時，量子點還可用于實時可視化監(jiān)控神經(jīng)元細(xì)胞膜上的電壓門控通道的生理作用。Gómez-Varela等[25]利用與特定抗體結(jié)合的量子點揭示并描述了Eag1在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜上通過Eag1通道的擴(kuò)散情況，并且發(fā)現(xiàn)橫向擴(kuò)散為Eag1進(jìn)出突觸為內(nèi)生性Eag1離子通道的最快的作用機(jī)制。該研究為其后通過量子點對細(xì)胞膜上電壓門控離子通道活動的深入研究提供了參考依據(jù)。

Chang等[26]以量子點標(biāo)記作為神經(jīng)信號傳導(dǎo)平臺的RN46A神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜脂筏，從而了解脂筏的擴(kuò)散動力學(xué)和模條塊分割。與常用的有機(jī)熒光團(tuán)相比，量子點雖然尺寸相對大了些(有機(jī)熒光團(tuán)的直徑≤1 nm；所用量子點直徑一般10～20 nm)，但卻可以顯著彌補有機(jī)熒光團(tuán)實時追蹤僅僅幾秒鐘的不足。并且，通過兩種方法最終得出的擴(kuò)散系數(shù)區(qū)別很小，說明量子點完全可以代替有機(jī)熒光團(tuán)用于單分子追蹤技術(shù)。

研究者還發(fā)現(xiàn)量子點可以應(yīng)用于探索海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜上蛋白合成過程與新合成蛋白的動力學(xué)，并克服了原來只能在同一時間在位可視化一或兩個蛋白的局限性[28]。最近，Arizono等[29]應(yīng)用量子點單顆粒示蹤來闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)源性代謝型谷氨酸受體(mGluR5)動力學(xué)，從而明確了mGluR5在細(xì)胞質(zhì)膜上橫向擴(kuò)散對細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號的重要性，也為今后繼續(xù)研究神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞間作用關(guān)系提供新的方法。由此可見，量子點獨特的特性使其有能力作為一種高級的工具應(yīng)用于研究外源化學(xué)物對機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)生理過程中神經(jīng)電動力學(xué)方面的影響。

2.3 量子點標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞

量子點作為一種優(yōu)秀的納米級熒光材料，標(biāo)記細(xì)胞可以作為其一項主要功能。早在2011年，國內(nèi)實驗室已經(jīng)成功以量子點標(biāo)記、追蹤神經(jīng)干細(xì)胞，并且確定量子點對神經(jīng)干細(xì)胞分化能力和由神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的蛋白表達(dá)沒有明顯影響[30]。Minami等[31]研究顯示量子點可以用于特異性地標(biāo)記和調(diào)節(jié)體外原代培養(yǎng)腦皮層和活體動物腦部的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且其熒光效果可維持較長時間。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為腦內(nèi)原位免疫細(xì)胞，廣泛參與各種腦損傷和神經(jīng)障礙，然而它們在腦部不同生理病理學(xué)狀態(tài)下的作用還不清楚。量子點對小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記幫助闡述了其在生物活性物質(zhì)傳遞中的作用機(jī)制，從而便于選擇合適的藥物完善小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能，治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

經(jīng)過特殊修飾的量子點通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ部梢栽诨铙w內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。Slotkin等[32]應(yīng)用新穎的母體子宮內(nèi)電穿孔和超聲定位的技術(shù)，在活體上直接高效地以量子點標(biāo)記哺乳動物發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)里的神經(jīng)干細(xì)胞，并且其沒有表現(xiàn)出長期副反應(yīng)。該研究證實了量子點可以應(yīng)用于哺乳動物活體發(fā)育過程中原基分布圖繪制、細(xì)胞遷移和神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究。此外，量子點獨特的理化性質(zhì)還可以使其標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)獨特的表現(xiàn)。Rao等[33]發(fā)現(xiàn)生物分子功能化的CdSe量子點可以根據(jù)特定方向自我裝配，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長和分化呈現(xiàn)極化現(xiàn)象。該特性也可用于探索細(xì)胞定位、成像和生物傳感等。

2.4 量子點追蹤生物活性分子

能夠有效地將細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)的生物活性分子可視化從而監(jiān)視追蹤一直是生物學(xué)研究的一個重要目標(biāo)，也是毒理學(xué)中外源化學(xué)物導(dǎo)致生物效應(yīng)的作用機(jī)制的研究基礎(chǔ)。在分子神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，研究者們發(fā)現(xiàn)單量子點技術(shù)可以在單分子水平上很好地追蹤調(diào)查神經(jīng)細(xì)胞膜蛋白[34]。目前，量子點作為熒光探針在標(biāo)記活體中或體外培養(yǎng)中的神經(jīng)生物活性分子上已經(jīng)取得了很大的突破。神經(jīng)生物活性分子連接上量子點后，神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和受體的遷移等可以被很好的實時追蹤。最近，Levi等[35]的一篇研究計劃就描述了量子點可以作為一種高敏感性方法用于長時間追蹤神經(jīng)細(xì)胞膜受體活動，從微觀角度探索細(xì)胞膜上分子運動。

圖2 在原代培養(yǎng)的大鼠腦皮層組織中，量子點(紅色)主要被標(biāo)記了anti-CD11b(綠色)或Anti-lba-1(綠色)的抗體內(nèi)在化；細(xì)胞核被DAPI標(biāo)記(藍(lán)色)[31]Fig. 2 In mixed primary cortical cultures from rats, QDs (red) were internalized primarily by microglia labeled with anti-CD11b (green) or anti-Iba-1 (green) antibodies. Nuclei were labeled with DAPI (blue)[31]

圖3 量子點的長期表達(dá)；量子點注射入C57BL/6小鼠海馬體7天后的觀察圖(A)與28天后的觀察圖(B)[31]Fig. 3 Long-term expression of QDs. QDs are observed 7 days (A) and 28 days (B)after injection into the hippocampus of adult C57BL/6 mice[31]

圖4 (A)實時圖像顯示了量子點的兩種轉(zhuǎn)送運動。白色箭頭指示單個BDNF-核內(nèi)體；白色三角指示了三個量子點標(biāo)記的BDNF在類MVB結(jié)構(gòu)中同時運動。(B)一個波動曲線記錄儀記錄了三個量子點標(biāo)記的BDNF在類MVB結(jié)構(gòu)中的并發(fā)運動和停頓模式[39]。Fig. 4 (A) Time-lapse images showing both transporting modes. White arrows indicated an individual BDNF-endosome while white arrow heads denoted three QD-BDNF moving together in a MVB-like structure.(B) A kymograph clearly showed the concurrent moving and pausing patterns of the three QD-BDNFs in a MVB-like structure[39].

量子點在標(biāo)記追蹤神經(jīng)遞質(zhì)受體方面已有的研究還有很多。Park等[36]應(yīng)用了與親和素(NTV)生物共軛的量子點來探測海馬神經(jīng)元上分布的絡(luò)氨酸激酶B(TrkB)受體，并發(fā)現(xiàn)TrkB受體在神經(jīng)元胞體上分布集中，而在軸突上卻呈點狀分布。因而，特定功能化的量子點可以用于建立神經(jīng)元的納米尺寸三維結(jié)構(gòu)形態(tài)。Geng等[37]已經(jīng)應(yīng)用鏈霉親和素共軛的量子點單分子標(biāo)記追蹤乙酰膽堿受體，從而證實肌肉細(xì)胞上受神經(jīng)突觸刺激后產(chǎn)生的乙酰膽堿受體裝配集群反應(yīng)經(jīng)由兩種明顯不同的分子過程：細(xì)胞膜上的受體布朗運動和突觸特化作用下的捕獲與固定。

此外，神經(jīng)系統(tǒng)中還有許許多多的生物活性分子的運輸與作用也可以通過量子點一一弄清。Osakada等[38]應(yīng)用量子點在全內(nèi)反射顯微鏡上實時可視追蹤了高空間和時間分辨率的背根神經(jīng)節(jié)上神經(jīng)生長因子運輸。Xie等[39]發(fā)現(xiàn)被量子點標(biāo)記的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，能夠毫無影響地被軸突終末的受體識別接受進(jìn)入海馬神經(jīng)元細(xì)胞。BDNF在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育和維持中扮演著重要的角色。為了能夠了解BDNF信號的傳播，追蹤BDNF進(jìn)出軸突終末會是很有效的方法。量子點優(yōu)越的光亮度與光穩(wěn)定性更使得對該蛋白的追蹤更清晰和長效。

目前，Chang等[40]已經(jīng)系統(tǒng)綜述了已有的量子點在分子神經(jīng)學(xué)中的應(yīng)用，其不但可以標(biāo)記神經(jīng)元受體和轉(zhuǎn)運蛋白，還可以用于研究目標(biāo)蛋白與神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)合后揭露潛在的神經(jīng)信號機(jī)制所造成的特定生理反應(yīng)，為未來量子點在神經(jīng)生物學(xué)和藥理學(xué)研究中的應(yīng)用提供了指南。但該應(yīng)用還有一定的局限性，目前無法做到在不引起后續(xù)細(xì)胞反應(yīng)的前提下標(biāo)記目標(biāo)蛋白。

2.5 量子點的實時成像功能

活體成像一直被認(rèn)為是量子點在生物科學(xué)上最重要的應(yīng)用。由于目前使用的實時成像中使用的熒光材料或熒光蛋白都存在很強(qiáng)的光漂白現(xiàn)象，量子點卓越的光穩(wěn)定性可以很好地解決此問題。優(yōu)秀的體內(nèi)成像將活體內(nèi)的生物過程在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)行特征顯示，有利于無創(chuàng)診斷外源化學(xué)物所導(dǎo)致的負(fù)面健康效應(yīng)或系統(tǒng)疾病。

已有研究顯示量子點可以用于視網(wǎng)膜變性大鼠的完整神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的標(biāo)記和成像，特別在構(gòu)造膠質(zhì)瘢痕和膠質(zhì)增生上顯示了量子點的突出性能[41]。Kantelhardt等[42]發(fā)現(xiàn)將上表皮生長因素(EGF)或單克隆抗體(MAb) anti-EGFR修飾的量子點用于特異性神經(jīng)膠質(zhì)瘤活組織檢測，可以在單細(xì)胞水平上從正常大腦組織中顯著區(qū)分出原位神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并且成像時不需要加強(qiáng)的MRI檢測圖像。若量子點被允許應(yīng)用于人體，該性能將更好地用于術(shù)中指導(dǎo)切除殘留的腫瘤細(xì)胞，提高病人存活率。

圖5 一間膠質(zhì)瘤Ⅱ期的MRI影像(A)和量子點為探針的數(shù)字低倍放大影像(B-E)[42]Fig. 5 MRI (A) and QD-probe digital macroimages (B-E) from glioblastoma multiforme, grade IV biopsy X[42]

此外，量子點同樣能用于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)突觸前端單個突觸囊泡的成像，從而更敏感準(zhǔn)確地監(jiān)測神經(jīng)突觸的運動[43]。神經(jīng)突觸傳導(dǎo)期間使用了胞外分泌的兩種模式：稱為經(jīng)典模式的全衰竭的融合(FCF)，即完全的囊泡融合，以及一種不完全的囊泡融合形式，被稱為“吻與跑”(K&R)。 然而，傳統(tǒng)的熒光探針很難實時以及高分辨率地區(qū)分并確定突觸囊泡的這兩種運動和行為。Zhang等[44]利用羧基修飾的量子點使得以納米精確度在三維空間實時監(jiān)測區(qū)分囊泡運動成為可能。由于量子點的尺寸只能通過FCF的融合孔，而不能通過K&R的，F(xiàn)CF能夠被觀察到一個突發(fā)的并且徹底的熒光性損失，從而區(qū)分兩種運動。雖然量子點在實時成像方面的應(yīng)用還有很多問題有待解決，但同樣昭示了其具大的潛力，值得研究者深入發(fā)掘。

2.6 量子點在外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運中的運用

早有報道，量子點可以攜帶藥物治療特定疾病[45]，其特異性和長期作用等優(yōu)點使其在外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運，尤其是藥物轉(zhuǎn)運中發(fā)揮了越來越重要的作用。然而，如要攜帶外源物質(zhì)進(jìn)入腦部的中樞神經(jīng)系統(tǒng)還將面臨一個最大的阻礙——血腦屏障(BBB)。血腦屏障作為一個復(fù)雜的生理檢查站，具有很高的選擇性，可以阻止血液中的很多異物從血液向中樞神經(jīng)系統(tǒng)擴(kuò)散。然而由于量子點的直徑為1～10 nm，Kato等[46]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)CdSe/ZnS修飾的量子點腹腔注射6小時后可經(jīng)血循環(huán)進(jìn)入實驗小鼠的肝臟、脾臟、腎臟和大腦。雖然量子點主要集中在肝臟、腎臟和大腦的血管中，但依舊有少量在大腦實質(zhì)分布。

圖6 量子點在海馬體中熒光圖像(右)與發(fā)射光譜(左)；ROI1為粒子值，ROI2為背景值[46]Fig. 6 Fluorescence image (right) and emission spectral profile (left) of QDs in hippocampus. In each figure, ROI (region of interest) 1 was placed on the particle, whereas ROI 2 was placed on the background[46]

圖7 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的量子點跨越血腦屏障示意圖。熒光圖顯示內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取入量子點[48]Fig. 7 Visulizing the trancytosisi of QDs-Tf across BBB real-time. The endothelial cells and astrocytes were imaged by laser scanning confocal microscope to confirm the uptake of QDs by both cells[48]

Walters等[47]在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)切片模型上以多聚兩性電解質(zhì)CL4修飾的量子點靶向神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)量子點可以攜帶生物活性物質(zhì)進(jìn)入特定的神經(jīng)元亞細(xì)胞空間，并且即使量子點暴露1年后，也沒有明顯的毒性反應(yīng)。揭示了量子點攜帶外源活性物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突出貢獻(xiàn)。Xu等[48]研究討論了經(jīng)特異生物分子功能化的量子點攜帶藥物跨越血腦屏障進(jìn)入大腦治療HIV相關(guān)腦病。量子點攜帶藥物轉(zhuǎn)運入腦不但提高了藥物利用率，減少藥物使用劑量，降低不良反應(yīng)率，還可以特定腦內(nèi)區(qū)域做靶向治療。同時由于量子點的熒光特性，我們更可以追蹤藥物在大腦中的轉(zhuǎn)運，一舉多得。

轉(zhuǎn)運的外源物質(zhì)除了藥物，還可以是基因信息。Bardi等[49]發(fā)現(xiàn)氨基修飾的量子點混合SiO2納米顆粒具有優(yōu)秀的能力結(jié)合、轉(zhuǎn)運、釋放DNA進(jìn)入人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，允許GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。目前，量子點在神經(jīng)毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用大致可分為以上五種，但我們相信，隨著量子點研究的逐漸深入，其應(yīng)用面將越加廣闊。

3 影響量子點應(yīng)用的因素

若要使量子點能夠在機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究方面發(fā)揮作用，量子點首先要能夠順利進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)。量子點由于體積微小和特殊的理化性質(zhì)，可以很輕易地跨越血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)?？梢哉f跨越血腦屏障(BBB)是存在于循環(huán)系統(tǒng)中的量子點進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要途徑。并且有研究結(jié)果顯示，如果將量子點進(jìn)行一定的表面修飾，可以明顯提高進(jìn)入腦組織的量子點數(shù)量[50]。除了血腦屏障途徑，吸入的納米顆粒也可以通過嗅覺神經(jīng)通路進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并轉(zhuǎn)移沉積于不同的大腦區(qū)域[21]，但由于大鼠與人明顯不同的生理和解剖特點，這就使得實驗動物的結(jié)果外推到人存在一定的局限性。除了嗅神經(jīng)可以轉(zhuǎn)運納米顆粒外，三叉神經(jīng)發(fā)出的感覺神經(jīng)末梢貫穿于鼻腔粘膜及嗅粘膜，呼吸暴露后鼻腔沉積的納米顆?？梢灾苯咏?jīng)末梢神經(jīng)轉(zhuǎn)運入腦[51]。目前，該途徑受到的關(guān)注不多，但該神經(jīng)途徑在今后可能的鼻吸量子點的研究與開發(fā)上有重要的意義。

以往大量研究可知，量子點的毒性大小和諸多因素有關(guān)，包括選用的化學(xué)材料、粒徑大小、結(jié)構(gòu)、修飾材料等[52]。而在量子點的應(yīng)用中，同樣有諸多因素會影響量子點或標(biāo)記、或成像的能力。首先，由于越來越多的研究者將目光放到了量子點活體成像的應(yīng)用上去，以求最大程度的發(fā)揮量子點的優(yōu)越性能，量子點的毒性大小就變得至關(guān)重要。由于不同器官組織對毒性的耐受性不同，我們可以根據(jù)需要成像的部位不同對所用量子點的優(yōu)缺點進(jìn)行適當(dāng)取舍，選擇最好的平衡點。

如上文中提到，為了使量子點能更好的適應(yīng)不同的應(yīng)用環(huán)境，我們常常需要對其進(jìn)行表面修飾，而該涂層常常決定了膠質(zhì)穩(wěn)定性，不同溶劑的溶解性，物理特性和細(xì)胞毒性，因而，表面修飾涂層的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)對量子點應(yīng)用于生物成像至關(guān)重要。Bakalova等[53]發(fā)現(xiàn)無交聯(lián)PAMAM化合物和氨基官能化的CdSe/ZnS量子點不適合活體脈管系統(tǒng)成像，因為其不但具有細(xì)胞毒性且無生物相容性，而且可以滲透入血管，影響成像質(zhì)量。而交聯(lián)羧基的CdSe/ZnS量子點則更適合體內(nèi)成像，因為此量子點將變得低毒并有良好的生物相容性。

該研究小組又以硅殼的量子點深入實驗，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)化是提高量子點成像能力不可缺少的一步。無PEG修飾的量子點膠質(zhì)穩(wěn)定性較低，易降解。PEG修飾既沒有顯著增加量子點的尺寸，又增加了其在循環(huán)中的半衰期。并且當(dāng)其濃度達(dá)到2.5 nmol/kg體重時，也沒有影響機(jī)體生理指標(biāo)，如血壓，心跳等，因而，PEG修飾的量子點十分適合活體動物的毛細(xì)血管成像，調(diào)查影響血管收縮、舒張和腦血循環(huán)的各項因素。Gao等[54]也通過實驗建立了包裹PEG涂層的量子點活體大腦成像平臺，該經(jīng)過很好修飾的量子點通過鼻吸轉(zhuǎn)運進(jìn)大腦，表現(xiàn)出優(yōu)越安全的腦靶向和成像性能。

量子點的尺寸同樣是決定量子點在何種情況下應(yīng)用的一項重要因素。雖然量子點的尺寸只在1～10 nm之間，但是由于其多用于研究分子作用，即使很小的差距在應(yīng)用上也可能產(chǎn)生很大的差異。例如為了能夠替代常用的有機(jī)熒光團(tuán)用于成像，量子點需要根據(jù)成像的部位、細(xì)胞或組織選擇合適的與所用的有機(jī)熒光團(tuán)尺寸大小最接近者，以求獲得最接近或更準(zhǔn)確的研究結(jié)果。

4 展 望

大量的研究結(jié)果已經(jīng)顯示，量子點在神經(jīng)毒理學(xué)研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。量子點優(yōu)越的光電學(xué)特性使其能用于可視化、測量與追蹤單分子物質(zhì)，并在較長的時間段內(nèi)(與有機(jī)熒光團(tuán)相比)研究分析動態(tài)的分子過程，這些都是很難通過其他科技方法獲得的。不可否認(rèn)，量子點將作為更簡單有效的研究方法在常規(guī)神經(jīng)毒理學(xué)實驗與醫(yī)療中逐漸得到應(yīng)有的重視。

但是，目前量子點在此方面的研究只單純停留在理論或動物實驗階段，依舊存在很多問題阻礙了量子點在生物學(xué)分支領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。大量研究顯示了量子點的細(xì)胞毒性和對細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的損傷，在活體動物上進(jìn)行的量子點研究也顯示了其對機(jī)體的負(fù)面生物效應(yīng)，如氧化應(yīng)激損傷、免疫反應(yīng)等；更在分子水平上探討了量子點的毒性機(jī)制問題，如量子點會導(dǎo)致凋亡相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)異常，促進(jìn)細(xì)胞死亡[20, 55]。因而若要使量子點可以通過審批，應(yīng)用于人體，如何降低其毒性，明確進(jìn)入機(jī)體的最佳濃度等將成為今后量子點生物安全性的研究重點。

此外，與現(xiàn)有的熒光探針相比，量子點相對較大的尺寸降低了其標(biāo)記細(xì)胞分子的穩(wěn)定性，并且降低了大規(guī)模的組織滲透性。除了尺寸效應(yīng)外，量子點進(jìn)入機(jī)體是否有可能產(chǎn)生抗體，以及溫度和環(huán)境pH值對其穩(wěn)定性是否存在影響都還并不清楚。另外，由于應(yīng)用于生物體的量子點通常需要在表面包裹涂層以增加生物相容性，但是涂層的化學(xué)物理性質(zhì)在不同情況下對量子點的應(yīng)用效果和毒性的影響并不清楚。許多應(yīng)用量子點于免疫熒光檢測試驗的結(jié)果顯示其敏感性顯著低于其他分析試驗。而究其原因是實驗設(shè)計的固有弱點，或應(yīng)用的抗體，還是量子點合并的結(jié)果，都還需要進(jìn)一步調(diào)查研究。

由此可見，雖然量子點優(yōu)越的光電學(xué)特性使其在生物學(xué)分子成像等方面的能力毋庸置疑，但是只有克服上述問題，解決潛在憂患才能保證量子點應(yīng)用于人體，在疾病的診斷和治療上做出突破性的貢獻(xiàn)。因而，我們還需要更多優(yōu)秀的實驗數(shù)據(jù)更好地理解量子點與生物系統(tǒng)間的相互作用，已達(dá)到其最有效的應(yīng)用效果。不可否認(rèn)，我們還有很長的一段路要走。

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Applications and Perspectives of Quantum Dots in Neurotoxicology

Wu Tianshu, Tang Meng*

Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China

Received 17 May 2014 accepted 20 June 2014

With the rapid development of nanotechnology, quantum dots (QDs), as a new type of nano-fluorescence probes, have been widely used in biology and toxicology due to their unique photoelectric properties. Moreover, QDs have introduced a technological innovation in the field of neurotoxicology, which as an important branch of toxicology. The primary focus of this review is the application of QDs in neurotoxicological studies as a novel single molecular technology and an excellent fluorescent probe. The routes of QDs entering into the nervous system and potential factors that could impact QDs’ applications were also briefly introduced here in order to guide further related researches on the biosafety and better applications of QDs.

nanotechnology; quantum dots; neurotoxicology; fluorescence probe; drug delivery

國家自然科學(xué)基金(30972504，81172697，81302461)；國家重大科學(xué)研究計劃項目(2011CB933404)；江蘇省基礎(chǔ)研究計劃 (No. BK2011606)

吳添舒(1989-)，女，博士研究生，研究方向為納米毒理學(xué)，E-mail: ninatshwu@gmail.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: tm@seu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140517001

2014-05-17 錄用日期：2014-06-20

1673-5897(2015)3-001-10

X171.5

A

唐萌(1958-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為納米毒理學(xué)。

吳添舒，唐萌. 熒光量子點在神經(jīng)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用及前景[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2015, 10(3): 1-10

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