李婷婷，劉 艷，馮立影，梁曉玲，趙海峰，劉高峰

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刺五加注射液對大鼠華法林抗凝作用的影響

李婷婷，劉 艷，馮立影，梁曉玲，趙海峰，劉高峰*

目的 研究刺五加注射液對大鼠華法林抗凝作用的藥效學和藥動學影響，為臨床合理用藥提供參考。方法 將Wistar雄性大鼠隨機分成空白對照組(A組)、刺五加注射液給藥組(B組)、華法林對照組(C組)、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組(D組)，4組大鼠連續(xù)腹腔注射生理鹽水或刺五加注射液(15 mL/kg)14 d。第8天，A、B兩組灌胃給予相同劑量的生理鹽水，C、D兩組灌胃給予華法林溶液(0.2 mg/kg)，并于設定的一系列時間點取血。用血凝分析儀測定凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)，并計算國際標準化比值(INR)。用UPLC-MS/MS法聯(lián)合手性色譜柱技術測定血漿中華法林(包括S-型和R-型)濃度，用DAS 2.0軟件計算藥代動力學參數(shù)。結(jié)果 刺五加注射液對PT、APTT及INR無明顯影響；與華法林對照組比較，合用刺五加注射液后，華法林(包括S-型和R-型)的藥動學參數(shù)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞等顯著升高(P<0.05或P<0.01)，藥效學參數(shù)PT及INR顯著增加(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 刺五加注射液可減慢華法林(包括S-型和R-型)的代謝，使華法林抗凝作用增強。提示臨床用藥時應盡量避免兩藥聯(lián)合應用，以避免出血風險，如必須聯(lián)用，應密切監(jiān)測。

華法林；刺五加注射液；抗凝作用；藥物相互作用

0 引言

華法林是應用最廣泛的口服抗凝藥物，主要用于預防和治療血栓栓塞性疾病，防止血栓的形成與發(fā)展，如防止深靜脈血栓、血栓性靜脈炎，降低肺栓塞的發(fā)病率與病死率，減少外科大手術、風濕性心臟病人工瓣膜置換術等的靜脈血栓發(fā)生率[1-2]。華法林因其蛋白結(jié)合率高、代謝依賴細胞色素P450酶及治療窗窄等特點，易與其他藥物發(fā)生相互作用，導致抗凝不足或出血不良反應增加，臨床用藥存在高風險性[3-4]。

刺五加注射液是臨床常用的中藥注射劑，具有平補肝腎、益精壯骨之功效，可用于治療冠心病心絞痛[5]、肝腎不足所致的短暫性腦缺血發(fā)作、腦栓塞、腦動脈硬化和腦血栓形成等[6]。由于其在心腦血管領域應用較多，與華法林聯(lián)合應用時是否對華法林的抗凝作用產(chǎn)生影響，目前尚無相關報道。本研究將從藥效學和藥動學兩個角度，探討刺五加注射液對華法林抗凝作用的影響，為兩藥聯(lián)用是否會產(chǎn)生藥物相互作用提供實驗依據(jù)，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用清潔級Wistar大鼠，雄性，體重(200±20)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部，合格證號：SYXK(黑)2006-033。

1.2 藥品與試劑 刺五加注射液(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶，批號：20121211)；華法林鈉片(上海信誼藥廠有限公司，華法林鈉2.5 mg/片，批號：18130503)；華法林鈉標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：101163-2001001)；S-華法林標準品、R-華法林標準品(加拿大TRC股份有限公司，純度98%)；甲氯噻嗪標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：101227-201101)；PT試劑(上海太陽生物技術有限公司，批號：105216)；APTT試劑(上海太陽生物技術有限公司，批號：111037)；乙腈、甲醇、乙酸銨為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 Waters UPLC XEVO TQ MS(美國waters公司)；SK5002雙通道血凝分析儀(深圳市盛信康科技有限公司)；230V-EU微型漩渦混合儀(美國愛迪生公司)；MC-19R冷凍離心機(昊諾斯生物公司)；KQ-500E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HGC-12A型氮吹儀(合肥信諾儀器有限責任公司)。

1.4 動物實驗

1.4.1 華法林溶液的配制 取1片華法林鈉片(2.5 mg/片)，置于研缽中，加少量吐溫80共研，加入50 mL純化水混勻，所配溶液華法林鈉的濃度為0.05 mg/mL。

1.4.2 動物分組與給藥 將Wistar大鼠隨機分成空白對照組(A組)、刺五加注射液給藥組(B組)、華法林對照組(C組)、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組(D組)，每組8只，4組大鼠在連續(xù)14 d內(nèi)腹腔注射生理鹽水(A組、C組)或刺五加注射液15 mL/kg(B組、D組)。第8天，A、B兩組大鼠灌胃給予相同劑量的生理鹽水，C、D兩組大鼠均同時灌胃給予華法林溶液0.2 mg/kg，并于設定的一系列時間點斷尾取血。

1.4.3 血漿樣品的采集與處理 藥效學研究血樣的采集與處理：4組大鼠灌胃給予生理鹽水或華法林溶液后，在0、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h分別取血0.1 mL，置于加枸櫞酸鈉抗凝液的離心管中，3 000 r/min離心15 min，取上清血漿測定PT及APTT。

藥動學研究血樣的采集與處理：C、D兩組大鼠灌胃給予華法林溶液后，在0.5、1、1.5、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h分別取血0.3 mL置于加肝素抗凝液的離心管中，9 000 r/min離心10 min。準確取大鼠血漿100 μL，加入甲氯噻嗪內(nèi)標溶液(2 μg/mL)50 μL后，加20 μL乙酸渦旋1 min，再加入3 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后，以3 500 r/min離心5 min，取乙酸乙酯層，40 ℃氮氣流下吹干，100 μL 50%乙腈水復溶，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機微孔濾膜，取續(xù)濾液5 μL注入進樣杯中，測定華法林(S-型和R-型)的血藥濃度。

1.5 凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)測定 取適量PT試劑置于血凝分析儀試劑預溫位中，37 ℃下預熱10 min。吸取20 μL血漿移至血凝分析樣品杯底部，預溫3 min，然后放入測試通道中，用聯(lián)機專用微量移液器吸取40 μL相對應的PT試劑后，測定PT值。

吸取20 μL血漿移至血凝分析儀樣品杯底部，加入20 μL的APTT試劑，置于血凝分析儀樣品預溫位，預溫5 min，然后放入測試通道中，用聯(lián)機專用微量移液器吸取20 μL的氯化鈣試劑，測定APTT值。

1.6 血漿中S-華法林和R-華法林濃度的測定

1.6.1 標準品溶液的配制 S-華法林標準品溶液的配制：精密稱取S-華法林標準品5.0 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的標準品溶液。R-華法林標準品溶液的配制：精密稱取R-華法林標準品5.0 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的標準品溶液。甲氯噻嗪內(nèi)標溶液的配制：精密稱取甲氯噻嗪10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的內(nèi)標溶液。

1.6.2 色譜條件 手性色譜柱(Astec CHIROBIOTICTMV，5 μm，2.1 mm×100 mm)，柱溫28 ℃，流動相5 mmol/L醋酸銨(pH 4.0)∶乙腈=85∶15，流速0.2 mL/min，進樣體積為5 μL。

1.6.3 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，負離子方式檢測，掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM)，毛細管電壓0.4 kV,去溶劑氮氣的溫度400 ℃，流速為650 L/h。華法林用于定量分析的離子碎片m/z為307.1→161.0，錐孔電壓35 V,碰撞能量21 eV；甲氯噻嗪m/z為357.9→321.9，錐孔電壓35 V，碰撞能量14 eV。

2 結(jié)果

2.1 刺五加注射液對大鼠體內(nèi)華法林抗凝作用的藥效學影響 用血凝分析儀分別測定4組大鼠的PT、APTT值，并根據(jù)PT值計算INR值。APTT Emax用來表示APTT的峰值，APTT Tmax用來表示APTT的達峰時間。結(jié)果分別見圖1、圖2和表1。

圖1 刺五加注射液對華法林藥效學影響試驗PT變化曲線

組別只數(shù)APTTEmax(s)APTTTmax(h)A組832．14±1．5136(24～48)B組831．99±1．7036(24～48)C組834．96±1．5936(24～48)D組837．37±3．5636(24～48)

2.2 刺五加注射液對大鼠體內(nèi)華法林抗凝作用的藥動學影響

2.2.1 S-華法林藥代動力學參數(shù)及藥時曲線 華法林對照組、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組中的S-華法林藥代動力學參數(shù)如表2所示，藥時曲線如圖3所示。

圖2 刺五加注射液對華法林藥效學影響試驗INR變化曲線

藥代動力學參數(shù)C組D組Cmax(ng/mL)416．95±43．35494．37±58．09?t1/2(h)32．46±2．0035．30±2．82AUC0?t(ng·h/mL)14231．63±4498．6123914．28±8787．67?AUC0?∞(ng·h/mL)17142．82±4064．6829551．88±9672．99?CL/F[mL/(h·kg)]0．0014±0．000520．0012±0．00045

注：與C組比較，*P<0.05

圖3 華法林對照組和華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組S-華法林的血藥濃度-時間曲線圖

2.2.2 R-華法林藥代動力學參數(shù)及藥時曲線 華法林對照組、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組中的R-華法林藥代動力學參數(shù)如表3所示，藥時曲線如圖4所示。

表3 刺五加注射液與華法林聯(lián)合給藥后大鼠R-華法林的藥代動力學參數(shù)變化(n=8)

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖4 華法林對照組和華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組R-華法林的血藥濃度-時間曲線圖

3 討論

本研究從藥效學和藥動學兩個方面評價了刺五加注射液對華法林抗凝作用的影響。采用血凝分析儀測定凝血指標PT、APTT值，并根據(jù)PT值計算INR值。通過對華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組和華法林對照組的藥效學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析和比較，評價刺五加注射液對華法林抗凝作用的藥效學影響；應用UPLC-MS/MS法聯(lián)合手性色譜柱技術測定S-華法林和R-華法林的血漿藥物濃度，用DAS 2.0軟件分別計算藥代動力學參數(shù)，通過對華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組和華法林對照組的藥動學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析和比較，評價刺五加注射液對華法林抗凝作用的藥動學影響。

由藥效學研究結(jié)果可見，刺五加注射液給藥組與空白對照組比較，PT、APTT及INR值均無統(tǒng)計學差異，表明刺五加注射液本身對凝血無影響。而刺五加注射液與華法林聯(lián)合給藥組和華法林對照組比較，聯(lián)合給藥組的PT值延長，INR值增大(P<0.01)，APTT峰值盡管沒有統(tǒng)計學差異，但有延長的趨勢，提示刺五加注射液使華法林抗凝作用增強，而且主要通過影響外源性凝血途徑。

藥動學研究結(jié)果顯示，刺五加注射液和華法林聯(lián)用后，可使華法林的藥動學參數(shù)發(fā)生改變，其中S-華法林的Cmax升高了18.57%(P<0.05)，

AUC0-t升高了68.04%(P<0.05)，AUC0-∞升高了72.39%(P<0.05)；R-華法林的Cmax升高了29.7%(P<0.01)，t1/2延長了31.27%(P<0.01)，AUC0-t升高了78.85%(P<0.05)，AUC0-∞升高了88.08%(P<0.05)。提示刺五加注射液可抑制華法林的代謝，且對S-型和R-型均有影響。華法林為外消旋異構(gòu)體，其S-型和R-型手性對映體活性不同，代謝途徑亦不同，S-華法林主要經(jīng)CYP2C9酶代謝，R-華法林主要經(jīng)CYP1A2和CYP3A4酶代謝。本課題組前期研究表明，刺五加注射液對CYP2C9和CYP3A4有抑制作用[7]，與華法林合用時，可由于其對CYP450酶的抑制作用而使華法林代謝減慢，抗凝作用增強。

結(jié)合藥效學和藥動學結(jié)果綜合分析，刺五加注射液與華法林聯(lián)合應用時，可減慢華法林代謝而導致INR增大，抗凝作用增強，兩藥聯(lián)用可產(chǎn)生代謝性藥物相互作用，使華法林出血風險增加。提示臨床用藥時，應盡量避免刺五加注射液和華法林聯(lián)合應用，以避免出血性不良反應的發(fā)生；如必須聯(lián)用，應密切監(jiān)測，并根據(jù)具體情況調(diào)整華法林劑量。

[1] 康俊萍.華法林臨床應用要點[J].中國醫(yī)刊,2014,49(1):11-14.

[2] 劉寅強.心臟瓣膜置換術后華法林個體化抗凝研究[D].昆明:昆明醫(yī)科大學博士論文,2013.

[3] 鄭必龍,劉俊.華法林抗凝血作用及影響因素分析[J].安徽醫(yī)藥,2013,17(11):1975-1977.

[4] 戴燁,汪宇.華法林的用藥教育[J].臨床合理用藥,2013,6(1):77-78.

[5] 王衛(wèi)民.刺五加注射液治療冠心病心絞痛的臨床觀察[J].北方藥學,2013,10(4):75.

[6] 呂朋飛.刺五加注射液治療腦梗塞的應用價值[J].醫(yī)學信息,2015,28(13):42.

[7] 曾超,劉艷,劉高峰,等.刺五加注射液對大鼠肝微粒體四種CYP450亞型酶活性的影響[J].中國臨床藥理學與治療學,2012,17(2):164-170.

Influence of ciwujia injection on anticoagulant effect of warfarin in rats

LI Ting-ting,LIU Yan,FENG Li-ying,LIANG Xiao-ling,ZHAO Hai-feng,LIU Gao-feng*

(Department of Pharmacy,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Key Laboratory of University in Heilongjiang Province,Harbin 150086,China)

Objective To study the effects of ciwujia injection on the pharmacodynamics and pharmacokinetics of warfarin in rats,and to provide reference for rational drug use of combination therapy.Methods Wistar rats were randomly divided into four groups,blank control group (group A),ciwujia injection group (group B),warfarin control group (group C),warfarin combined ciwujia injection group (group D),eight rats in each group.The rats of four group swere administered physiological saline or ciwujia injection (15 mL/kg) by caudal vein for 14 consecutive days.On the 8th day,rats in group A and group B were orally administered with the same dose of physiological saline,and rats in group C and group D were orally administered with warfarin solution (0.2 mg/kg).The blood samples were collected from the caudal veins at different time points.The prothrombintime (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) of the blood samples were determined by coagulation analyzer,and the blood concentrations of S-warfarin and R-warfarin were determined by UPLC-MS/MS.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.Results Ciwujia injection had no effect on PT,APTT and INR,but ciwujia injecion combined with warfarin could increase the blood concentrations of warfarin (including S-type and R-type,P<0.05 orP<0.01)and the valne of PT and INR significantly (P<0.05 orP<0.01).Conclusion Ciwujia injection could decrease the metabolism of warfarin (including S-type and R-type),and increase the anticoagulant effect.Therefore,the combination use of the two drugs should be refrained,in order to avoid the risk of bleeding.Special monitoring should be carried out if the combination therapy is used.

Warfarin;Ciwujia injection;Anticoagulant effect;Drug interactions

2015-08-31

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部，哈爾濱

150086

國家自然科學基金項目(81173659)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511003

*通信作者