陳小舉， 李興江， 姜紹通

（1.巢湖學(xué)院 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

琥珀酸是具有潛力的大宗生物基化學(xué)品，被廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)［1］。作為聚丁二酸丁醇酯（PBS）的合成前體，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸一直是研究的熱點(diǎn)［2－4］。文獻(xiàn)［5］對(duì)鈍齒棒桿菌（Corynebacteriumcrenatum）的研究結(jié)果表明，C.crenatum在厭氧發(fā)酵時(shí)可以分泌大量的琥珀酸。文獻(xiàn)［6］在利用C.crenatum厭氧發(fā)酵時(shí)，流向乳酸的碳代謝流量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于流向琥珀酸的碳代謝流量，C.crenatum所吸收的葡萄糖有70%轉(zhuǎn)化為乳酸，由此可知，乳酸是C.crena－tum厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸時(shí)的主要副產(chǎn)物。如果要增加琥珀酸的產(chǎn)量，首先需要通過代謝工程減少流向乳酸的碳代謝流量，而敲除乳酸脫氫酶基因（ldhA）可以達(dá)到減少乳酸生成的目的，成功構(gòu)建敲除載體則是敲除乳酸脫氫酶基因的首要環(huán)節(jié)。

基因敲除是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的一種技術(shù)。它克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。該技術(shù)已成功應(yīng)用于Corynebacteriumglutamicum7與Escherichiacoli［8］等琥珀酸生產(chǎn)菌的代謝途徑改造，減少了副產(chǎn)物的生成。文獻(xiàn)［9］通過構(gòu)建γ－谷氨酰激酶基因（proB）敲除載體，獲得了proB基因缺陷的菌株，搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，與出發(fā)菌株相比，缺陷株生物量降低9.6%，L－精氨酸產(chǎn)量提高13.6%。

插入抗性基因打斷目的基因是基因敲除方法的一種，其原理是在目的基因的特定酶切位點(diǎn)處插入一段抗性基因而達(dá)到將目的基因完整性予以破壞的目的。本研究旨在構(gòu)建乳酸脫氫酶基因敲除載體，為后續(xù)敲除鈍齒棒桿菌乳酸脫氫酶基因以增加琥珀酸產(chǎn)量奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

所用質(zhì)粒如下：pMD18－T simple特征為Apr，ori of ColE1，購自寶生物工程有限公司；pEASYTMT1特征為Apr、kmr、ori of f1，購自全式金生物技術(shù)有限公司；pMA特征為pMD18－T simple carryingldhA，pKA特征為pMD18－T simple carryingkm，pMKA 特征為 pMD18－T simple carryingldhA：：Ωkm，均為本實(shí)驗(yàn)室研究。

所用菌株如下：CorynebacteriumcrenatumCICC20219為野生、典型菌株，購自CICC；E.coliJM109特 征 為 recA1end A1gyrA96thi－1hsdR17（rk－，mk＋）relA1supE44Δ（lac－proAB）［F’traD36proAB laclqZΔM15］，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：葡萄糖（5g／L）、蛋白胨 （10g／L）、酵母膏（5g／L）、NaCl（10g／L），pH 值為7.0，0.1MPa滅菌15min。抗生素為氨芐青霉素（100μg／mL）和卡那霉素（50μg／mL）。

1.1.3 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、低熔點(diǎn)瓊脂糖購自TKaRa公司。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain raction，PCR）引物合成及PCR試劑由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)有限公司。氨芐青霉素和卡那霉素為sigma公司產(chǎn)品。DNA marker購自寶生物工程有限公司，型號(hào)為250bp DNA Ladder Marker。蛋白胨和酵母膏購自O(shè)XOID公司，其他試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

TC－96PCR儀（杭州博日科技有限公司）、Multiporator電轉(zhuǎn)化儀（Eppendorf公司）、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad公司）。

1.1.5 引物

根據(jù)genebank上公布的Corynebacterium glutamicumldhA基因序列和pEASYTM－T3上km序列分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物（5′－3′）：

引物P1與P2用于擴(kuò)增C.crenatum的乳酸脫氫酶基因ldhA，分別含有SalI酶切位點(diǎn)。引物P3與P4用于擴(kuò)增卡那霉素抗性基因km，分別含有EcoRV酶切位點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 操作

E.coli質(zhì)粒提取、E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備與CaCl2法轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)［10］。C.crenatum基因組的提取參照文獻(xiàn)［11－12］。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增采用50μL體系。基因ldhA的PCR反 應(yīng) 條 件 為：94 ℃，3min；94 ℃，1min；55℃，30s；72℃，1min；30個(gè)循環(huán)后于72 ℃再延伸7min?；騥m的PCR反應(yīng)條件為：94℃，3min；94 ℃，1min；57 ℃，30s；72 ℃，1min；30個(gè)循環(huán)后于72℃ 再延伸7min。

1.2.3 乳酸脫氫酶基因敲除載體的構(gòu)建

利用EcoRV內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pMA與PCR擴(kuò)增的卡那霉素抗性基因片段km進(jìn)行酶切，分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收，將回收后的片段進(jìn)行連接得敲除載體pMKA，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 敲出載體pMKA結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

以C.crenatum基因組為模板PCR擴(kuò)增ldhA基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果并對(duì)片段進(jìn)行回收。將凝膠回收的ldhA基因片段連入pMD18－T simple質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取pMA質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證以確認(rèn)擴(kuò)增的片段為ldhA基因。

2 結(jié)果與討論

2.1 ldhA基因片段克隆

以鈍齒棒桿菌（C.crenatumCICC20219）基因組DNA為模板，以P1／P2為引物，PCR擴(kuò)增ldhA基因片段，結(jié)果如圖2所示。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，1～4泳道出現(xiàn)了比較明亮的條帶，且擴(kuò)增的基因片段大小與預(yù)期的片段大?。ù蠹s1 000bp）相符，表明PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為ldhA基因片段。PCR擴(kuò)增結(jié)果較為理想，故而可以進(jìn)一步對(duì)其做膠回收、純化，留作后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。

圖2 基因ldhA的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 pMA質(zhì)粒構(gòu)建

將回收后的ldhA基因片段與pMD18－T simple載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌株并提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，以P1／P2為引物，PCR擴(kuò)增ldhA基因片段，以驗(yàn)證ldhA基因片段是否與pMD18－T simple載體連接成功。如果ldhA與pMD18－T simple連接成功，則提取的質(zhì)粒中必然含有l(wèi)dhA片段，理論上利用ldhA的PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增就能得到ldhA的擴(kuò)增片段。PCR結(jié)果電泳圖如圖3所示。

由圖3可知，1、4泳道上未見目的條帶，說明提取的質(zhì)粒中不含ldhA片段，其對(duì)應(yīng)的為假陽性重組子；在2、3、5泳道上有大約1 000bp的條帶，大小與目的片段相符，因而可以斷定PCR擴(kuò)增出了ldhA片段，證明ldhA與pMD18－T sim－ple已成功連接，其對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒即為本實(shí)驗(yàn)所要構(gòu)建的pMA載體。

圖3 pMA重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證

2.3 卡那霉素抗性基因km的克隆

以質(zhì)粒pEASYTM－T1為模板，以P3／P4為引物，PCR擴(kuò)增km基因片段。瓊脂糖凝膠電泳圖如圖4所示。由圖4可以看出，在PCR擴(kuò)增的2管平行樣所對(duì)應(yīng)的2、3泳道上可見明亮條帶，且條帶大小與目的片段相符，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段，且PCR擴(kuò)增結(jié)果較為理想，故而可以進(jìn)一步對(duì)其做膠回收、純化，然后連入pMD18－T simple質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pKA。

圖4 基因km的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 乳酸脫氫酶基因敲除載體的構(gòu)建

將質(zhì)粒pMA進(jìn)行EcoRV酶切并回收大片段，同時(shí)將質(zhì)粒pKA進(jìn)行EcoRV酶切并回收小片段，然后將分別回收的片段進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pMKA。將質(zhì)粒pMKA轉(zhuǎn)化為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌株并提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，以P1／P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增與酶切驗(yàn)證。PCR結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)的4個(gè)平行樣中，只有1、4泳道在2 250bp附近的位置出現(xiàn)目的條帶，其大小正好符合ldhA與km片段之和，表明pMA質(zhì)粒與km連接成功。

敲除質(zhì)粒pMKA的實(shí)際大小為4 714bp左右，經(jīng)過SalI酶切后應(yīng)得到2個(gè)片段，一個(gè)是質(zhì)粒pMD18－T simple除去小片段后剩下的部分，大小約為2 600bp，另一個(gè)是km片段和ldhA基因片段組成的大小約為2 200bp的片段。

圖5 pMKA重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證km片段是否能成功連接到乳酸脫氫酶基因中的EcoRV特異性酶切位點(diǎn)，本文對(duì)pMKA敲除質(zhì)粒進(jìn)行了SalI與EcoRV酶切驗(yàn)證。酶切結(jié)果如圖6所示。

由圖6a可知，在1泳道與2泳道分別有2條條帶，其大小約為2 600bp和2 200bp，表明km基因片段成功插入到ldhA片段中。由圖6b可知，泳道2中有2條條帶，分別為經(jīng)EcoRV酶切的km基因片段（1 000bp左右）和去掉km基因片段的pMKA剩余片段（3 700bp左右），表明km基因片段成功連入到ldhA片段中的EcoRV酶切位點(diǎn)，ldhA敲除質(zhì)粒pMKA構(gòu)建成功。

圖6 敲除質(zhì)粒pMKA的酶切鑒定

3 結(jié)束語

本文利用鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸時(shí)，乳酸是其主要副產(chǎn)物。乳酸脫氫酶是鈍齒棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的關(guān)鍵酶，通過構(gòu)建乳酸脫氫酶基因敲除載體可以用于敲除乳酸脫氫酶基因以達(dá)到減少乳酸生成、增加琥珀酸產(chǎn)量的目的。為此本文主要介紹了乳酸脫氫酶基因敲除載體的構(gòu)建方法及主要過程。首先將克隆到的ldhA基因與質(zhì)粒pMD18－T simple連接得到質(zhì)粒pMA，再將km基因插入到ldhA基因中的EcoRV酶切位點(diǎn)，得到載體pMKA。質(zhì)粒PCR與酶切結(jié)果顯示乳酸脫氫酶基因敲除載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)乳酸脫氫酶基因的敲除實(shí)驗(yàn)。

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