蔡良英，趙 陽，丁春燕，陶 蕓

（湖州市德清縣食品藥品檢驗(yàn)所，浙江湖州 313200）

基于高效液相色譜的一種測定雞蛋中三聚氰胺殘留的方法

蔡良英，趙 陽，丁春燕，陶 蕓

（湖州市德清縣食品藥品檢驗(yàn)所，浙江湖州 313200）

針對雞蛋中的三聚氰胺，建立一套基于高效液相色譜的快速測定方法。以50%甲醇－1%三氯乙酸為提取溶液，經(jīng)超聲、離心、正己烷除脂后，陽離子固相萃取柱凈化，采用庚烷磺酸鈉離子對試劑∶乙腈（85∶15，V∶V）為流動(dòng)相，C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），外標(biāo)法定量。該方法在0.5～80μg·mL－1線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，加標(biāo)回收率94.58%～97.62%，定量限為0.3mg·kg－1。

三聚氰胺；高效液相色譜；雞蛋

三聚氰胺是一種重要的化工原料，屬于非蛋白質(zhì)含氮化合物，含氮量高達(dá)66.67%，常被違規(guī)加入食品中以提升蛋白質(zhì)含量指標(biāo)。近年來發(fā)生的一系列含三聚氰胺有毒食品事件嚴(yán)重?fù)p害我國居民的身體健康，引發(fā)了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。目前，食品中三聚氰胺的測定方法主要有液相色譜法［1－2］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［3］、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法［4－5］、毛細(xì)管電泳法［6－7］、離子色譜法［8］、酶聯(lián)免疫吸附法［9］、表面等離子體共振（SPR）技術(shù)［10－11］、近紅外光譜法［12］以及表面增強(qiáng)拉曼光譜法［13－14］，其中，高效液相色譜法操作相對簡單、運(yùn)行成本低、是目前最為常用的檢測方法。由于樣本基質(zhì)的差異性，針對飼料、乳制品中三聚氰胺建立起來的測定方法并不適用于雞蛋的測定。本文擬在現(xiàn)有國家檢測標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，簡化樣品前處理過程、優(yōu)化色譜條件，建立針對雞蛋中三聚氰胺的高效液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國Agilent 1260型高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測器）；C18色譜柱（Agilent，5μm，4.6 mm×250 mm）；PCX固相萃取小柱（美國Agilent公司）。甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），三氯乙酸（分析純），庚烷磺酸鈉（色譜純），三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 m L容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。臨用前用50%甲醇水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行測定。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

取雞蛋打碎后用勻質(zhì)器勻質(zhì)1min，稱取5 g（精確至0.01 g）于25 mL具塞比色管，加入15 mL 1%三氯乙酸、5mL 50%甲醇，超聲提取20min后加1%三氯乙酸定容，6 000 r·min－1離心10min。取上清液加入三氯乙酸飽和的正己烷除脂，8 000 r·min－1 4℃離心10min，取上清液5mL待凈化。

1.3.2 凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL 1%三氯乙酸活化固相萃取小柱。將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用3 mL 1%三氯乙酸、3 mL甲醇洗滌。抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液分2次洗脫。洗脫液于50℃用氮?dú)獯抵两?，殘留物用流?dòng)相定容，旋渦混合1 min，移取上清液過0.45μm微孔濾膜后，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為庚烷磺酸鈉離子對試劑緩沖溶液／乙腈混合液（85∶15，V／V）；流速1.0 mL·min－1；柱溫40℃；檢測波長240 nm；進(jìn)樣量20μL。以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件選擇

三聚氰胺具有弱堿性，可溶于甲醇和乙腈，而三氯乙酸能使其轉(zhuǎn)化成鹽。考慮到乙腈的毒性和沉淀蛋白條件，本文選用50%甲醇和1%三氯乙酸為提取液。1%三氯乙酸能夠給三聚氰胺提供酸性環(huán)境，使其很好地溶解在上清液中，減少目標(biāo)檢測物的損失。考慮到雞蛋與牛奶樣品的差異，在提取液中特別加入甲醇沉淀蛋白，同時(shí)增加正己烷去脂步驟，以達(dá)到較好的凈化效果。

另有文獻(xiàn)［15－16］報(bào)道，提取液不經(jīng)過小柱凈化而直接進(jìn)樣測定，雖然節(jié)約了檢測成本，但長時(shí)間、大批量的檢測樣品會(huì)對儀器，尤其是色譜柱造成不良影響。小柱洗脫過程中存在離子交換，為使洗脫液與萃取柱填充物充分接觸，洗脫速度不宜過快。試驗(yàn)表明，洗脫流速小于1.5 mL·min－1時(shí)，回收率較理想。

2.2 方法評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.2.1 測定方法的線性范圍和檢出限

配制一系列濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜峰面積對三聚氰胺進(jìn)樣濃度進(jìn)行線性回歸，其線性范圍為0.5～80μg·m L－1，線性方程為A＝85.655C＋3.149，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖1。按信噪比（S／N）為10計(jì)算，本方法定量限為0.3mg·kg－1。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)中對食品中三聚氰胺的安全限值設(shè)定為2.5 mg· kg－1，可知本方法可以滿足檢測的要求。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)圖譜

2.2.2 加標(biāo)回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取雞蛋樣品5.00 g，分別進(jìn)行0.40，1.00，2.00，4.00 mg·kg－1 4個(gè)水平的加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行?；厥章示芏冉Y(jié)果見表1。結(jié)果表明，在0.40～4.00 mg· kg－1的添加水平上，樣品的回收率為94.58%～97.62%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%～3.09%，符合測定要求。添加1.00 mg·kg－1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的雞蛋樣品以及空白雞蛋樣品的液相色譜圖見圖2。

表1 精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

圖2 三聚氰胺加標(biāo)樣品（a）與空白樣品（b）液相色譜圖

3 小結(jié)

本文建立起一套基于高效液相色譜的快速檢測雞蛋中三聚氰胺的方法，該方法前處理過程簡單，測試結(jié)果穩(wěn)定且精確度較高，可滿足實(shí)際檢測要求。

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（責(zé)任編輯：高 峻）

O 657.7；TS 253.7

A

0528?9017（2015）11?1772?02

文獻(xiàn)著錄格式：蔡良英，趙陽，丁春燕，等.基于高效液相色譜的一種測定雞蛋中三聚氰胺殘留的方法［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（11）：1772－1773，1776.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151121

2015?09?06

蔡良英（1988－），女，浙江湖州人，碩士，主要從事食品藥品檢驗(yàn)與分析工作。E?mail：liangying_cai＠126.com。