柳愛春，劉 超，趙 蕓，陳青舟，張宣偉

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江杭州 310024；2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江杭州 310022）

膠體金法和質(zhì)譜法檢測禽蛋中喹諾酮類殘留的比較

柳愛春1，劉 超1，趙 蕓1，陳青舟2，張宣偉2

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江杭州 310024；2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江杭州 310022）

分別采用多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）制備檢測喹諾酮類藥物的免疫膠體金試劑盒檢測杭州地區(qū)市售禽蛋樣品128份，用多抗試劑盒檢出24份陽性樣品（占總樣品量的18.8%），其中14份為強陽性樣品（占總樣品量的10.9%）；用單抗試劑盒檢出42份陽性樣品（占總樣品量的32.8%），其中24份為強陽性樣品（占總樣品量的18.8%）。所有樣品再用液相?串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS／MS）法檢測氟甲喹、諾氟沙星、依諾沙星等12種喹諾酮類藥物殘留量，檢測結果為喹諾酮類殘留總量＞100μg·kg－1的樣品14份、20～100μg·kg－1的樣品10份、2.0～20μg·kg－1的樣品16份、0.2～2.0μg·kg－1的樣品16份，2種不同的免疫膠體金試劑盒快速檢測結果與質(zhì)譜法的符合率分別為100%和95%。試驗表明，膠體金法和質(zhì)譜法各有優(yōu)勢且結果符合性好。

喹諾酮類藥物；禽蛋；膠體金法；快速檢測

喹諾酮類（Quinolones，QNs）是一類化學合成的抗菌藥，由于這類藥物高效低毒、價格低廉，少量使用還有一定的促生長作用，因此近年來被廣泛應用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中預防、治療疾病。但是在長期使用過程中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)該類藥物在動物體內(nèi)消除緩慢，過量或不當使用會造成動物產(chǎn)品中的殘留和蓄積。人體攝入后，除了可能會引起關節(jié)病變、消化道反應、肝腎毒性、血液系統(tǒng)毒性等不良反應外，長期食用含低劑量抗生素，還導致產(chǎn)生耐藥性［1］，甚至產(chǎn)生超級細菌［2］，從而不利于該類藥物對人類疾病的治療。在農(nóng)業(yè)部235號公告中，規(guī)定產(chǎn)蛋雞禁用恩諾沙星。到目前為止，雞蛋中藥物殘留的檢測方法報道較少，大多數(shù)是在動物組織殘留檢測方法的基礎上進行改進的，這也是雞蛋中獸藥殘留控制的一大問題。因此，尋找高靈敏度、簡單、快速、低成本的檢測方法是解決獸藥殘留的關鍵所在。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

禽蛋樣品。購自杭州市區(qū)多家超市和農(nóng)貿(mào)市場的雞蛋114份、鴨蛋5份、鵪鶉蛋4份、鴿子蛋4份、鷓鴣蛋1份。

1.1.2 試劑

喹諾酮多克隆抗體免疫膠體金試劑盒（多抗試劑盒）和單克隆抗體免疫膠體金試劑盒（單抗試劑盒）系實驗室自制，含免疫膠體金試劑板、復溶液和小滴管；12種氟喹諾酮標準物質(zhì)：氟甲喹Flumequine（簡寫Flu）、諾氟沙星Norfloxacin（簡寫Nor）、依諾沙星Enoxacin（簡寫Eno）、環(huán)丙沙星Ciprofloxacin（簡寫Cip）、培氟沙星Pefloxacin（簡寫Pef）、洛美沙星Lomefloxacin（簡寫Lom）、丹諾沙星（達氟沙星）Danofloxacin（簡寫Dan）、恩諾沙星Enrofloxacin（簡寫Enr）、氧氟沙星Ofloxacin（簡寫Ofl）、麻保沙星Marbofloxacin（簡寫Mar）、沙拉沙星Sarafloxacin（簡寫Sar）、雙氟沙星Difloxacin（簡寫Dif）標準品（純度≥99%）；乙腈、甲醇、正己烷均為色譜純。

1.1.3 儀器與設備

Waters Xevo TQ?S液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國）；METTLER電子天平（上海）：感量0.01 g和0.0001 g；IKA磁力攪拌器和漩渦混勻器；KH3200DE超聲波儀（昆山）；Eppendorf 5810臺式離心機（德國）；N?EVAP氮吹儀（美國）；Thermo 10～100μL，100～1 000μL，1～5 mL移液器。

1.2 樣品制備

將剛采集的樣品編號加標識后，每個樣品取1～3枚蛋，去殼后，將蛋黃和蛋清一起勻漿制成蛋液，并立即以多抗試劑盒用免疫膠體金法快速篩檢，蛋液留樣用5 m L冷凍管分裝，－20℃保存，以備膠體金法復檢和LC?MS／MS法定量檢測用；完整的禽蛋則根據(jù)膠體金法篩檢結果分成陽性組和陰性組，于4～8℃冷藏保存。

1.3 多抗試劑盒免疫膠體金法快速篩檢

快速篩檢采用設計檢測限為20μg·kg－1多抗免疫膠體金試劑盒，用滴管吸取0.5 mL蛋液，加1 mL復溶劑，搖勻制成待檢溶液；從鋁箔袋中取出膠體金試劑板；用滴管吸取待檢溶液垂直滴加4滴（約125μL）于試劑板的加樣孔中；加樣后開始計時，在3～5 min內(nèi)用肉眼觀察結果，結果判定原則參照文獻［3］。

1.4 單抗試劑盒免疫膠體金法復檢

復檢采用設計檢測限為2μg·kg－1單抗免疫膠體金試劑盒，實驗方法基本參照1.3節(jié)稍加改動，一是樣品稀釋倍數(shù)改為4倍，即吸取1 mL蛋液，加4 m L復溶劑，搖勻制成待檢溶液；二是顯色時間改為在5～8 min內(nèi)讀取結果。

1.5 用LC?MS／MS法檢測禽蛋中喹諾酮類藥物

稱取2.00 g樣品于15 mL試管中，加入4 mL酸化乙腈（2%甲酸）溶液，漩渦混勻，超聲3min，4 000 r·min－1離心5 min，取上清，沉淀用4 mL酸化乙腈重復提取一次，合并上清，定容至25 mL。提取液中加入10 m L乙腈飽和正己烷溶液，振蕩5 min，棄去上層正己烷，重復凈化一次。氮氣吹干。準確加入1 mL甲醇溶解，再加入1 mL水超聲30 s，過0.22μm濾膜，制成上機待測液。LC?MS／MS測定的儀器條件：流動相A液為100%乙腈；B液為0.1%甲酸水溶，其他條件參照標準［4］，根據(jù)色譜保留時間和質(zhì)譜碎片及其離子豐度比定性；外標法定量，分別通過計算峰高和峰面積定量。

2 結果與分析

2.1 膠體金法快速檢測結果

用多抗試劑盒對所有樣品進行現(xiàn)場快速篩檢，共檢出24份陽性樣品（占總樣品量的18.8%），其中14份為強陽性樣品（占總樣品量的10.9%）。用肉眼觀察試劑板T線和C線的顯色情況（圖1），1＃和2＃樣品T線比C線深或一樣深，視為陰性；3＃樣品T線比C線淺為陽性；10＃、11?1＃和11?2＃樣品T線不顯色視為強陽性。用單抗試劑盒對所有樣品進行復檢，共檢出42份陽性樣品（占總樣品量的32.8%），其中24份為強陽性樣品（占總樣品量的18.8%）。

圖1 肉眼觀察試劑板T線和C線的顯色情況

2.2 LC?MS／MS法檢測結果

所有樣品再用液相?串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS／MS）法檢測氟甲喹、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、麻保沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等12種喹諾酮類藥物殘留量，測得喹諾酮類殘留總量＞100μg· kg－1（實測值為110～2 137μg·kg－1）的樣品14份，殘留總量在20～100μg·kg－1（實測值為24.3～86.6μg·kg－1）的樣品10份；殘留總量在2.0～20μg·kg－1（實測值為2.0～11.7μg· kg－1）的樣品16份；殘留總量為0.2～2.0μg· kg－1（實測值為0.23～1.98μg·kg－1）的樣品16份。不同污染程度樣品所占比例見圖2。

圖2 按喹諾酮殘留總量計不同污染程度樣品所占比例

所檢的12種喹諾酮類藥物均有檢出，其中檢出率最高的是環(huán)丙沙星和氧氟沙星，各33份，其次為檢出恩諾沙星的樣品14份，諾氟沙星9份，依諾沙星8份，培氟沙星6份，氟甲喹和洛美沙星各3份，丹諾沙星、麻保沙星和雙氟沙星各2份，沙拉沙星1份。環(huán)丙沙星和氧氟沙星不僅檢出率高，殘留量也很高，環(huán)丙沙星殘留量大于100μg· kg－1的樣品有7份，其最高殘留量為715μg·kg－1；氧氟沙星殘留量大于100μg·kg－1的樣品有5份，其最高殘留量為601μg·kg－1（圖3），該樣品中還檢出麻保沙星留量為4μg·kg－1。培氟沙星的最高殘留量達2 026μg·kg－1，該樣品中還檢出諾氟沙星、依諾沙星和環(huán)丙沙星，總殘留量高達2 137μg·kg－1。

表1 LC?MS／MS法測得禽蛋中喹諾酮類殘留總量

圖3 氧氟沙星殘留量最高的樣品質(zhì)譜圖

2.3 膠體金法和質(zhì)譜法檢測結果比較

采用檢測限為20μg·kg－1的多抗免疫膠體金試劑盒共檢出24份陽性樣品（其中強陽性樣品14份），與質(zhì)譜法檢出喹諾酮總殘留量＞20μg·kg－1樣品合計24份（其中總殘留量＞100μg·kg－1的樣品14份），兩種方法的檢測結果符合率為100%。

采用檢測限為2μg·kg－1的單抗試劑盒檢出24份強陽性樣品，與質(zhì)譜檢測結果完全相符。單抗免疫膠體金試劑盒共檢出42份陽性樣品，與質(zhì)譜法檢出殘留總量＞2μg·kg－1的樣品共40份相比較，符合率為95%，其中2個不相符的樣品，質(zhì)譜法檢測殘留總量分別為1.98和1.30μg· kg－1，1.98μg·kg－1的樣品檢出為陽性，認為在判定誤差范圍允許之內(nèi)；殘留總量1.30μg·kg－1的樣品膠體金法檢出為陽性，而其他殘留總量在1.44～1.94μg·kg－1均檢出為陰性，可能是因為除了本次實驗中質(zhì)譜所檢的12種之外，還存在其他種喹諾酮藥物殘留，根據(jù)抗體研制時的測試結果，該抗體可與15種以上的喹諾酮藥物發(fā)生反應。

3 小結與討論

通過以膠體金法和質(zhì)譜法檢測禽蛋中喹諾酮殘留的比較發(fā)現(xiàn)，這兩種方法檢測結果高度相符，且在禽蛋質(zhì)量安全監(jiān)測與控制中各有優(yōu)勢：膠體金法的主要優(yōu)點是快速、方便，適合于現(xiàn)場快速檢測，若參照農(nóng)業(yè)部235號公告中畜禽肉中100μg·kg－1的限量要求，無論是多抗試劑盒還是單抗試劑盒的檢測靈敏度均能完全滿足質(zhì)控要求；質(zhì)譜法的主要優(yōu)點是定性和定量準確，因此，這兩種方法分別適合于現(xiàn)場檢測和實驗室確證及定量檢測。

盡管農(nóng)業(yè)部明令禁止在產(chǎn)蛋雞中使用喹諾酮類藥物，在研究中也發(fā)現(xiàn)杭州市在售禽蛋中的喹諾酮類殘留情況較為嚴重，與目前我國養(yǎng)殖業(yè)不規(guī)范用藥和在飼料中添加抗生素有關，這種禁而不止的現(xiàn)象多年來屢見不鮮，因此現(xiàn)場快速檢測方法的研究對推進市場準入制度和產(chǎn)地準出制度的實施具有比較現(xiàn)實的意義。

［1］ 李金梅，李雨珊，劉華，等.健康兒童腸道大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs菌株耐藥性研究［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2015，12（3）：210－211.

［2］ 張國成.重視兒童超級細菌感染的診斷與治療的研究［J］.發(fā)育醫(yī)學電子雜志，2014，2（4）：193－197.

［3］ 柳愛春，劉超，趙蕓，等.免疫膠體金法快速檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2013，25（1）：95－102.

［4］ GB／T 21312—2007動物源性食品14種喹諾酮藥物殘留檢測方法液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

（責任編輯：盧福莊）

S 83；TS 207.5

A

0528?9017（2015）11?1763?03

文獻著錄格式：柳愛春，劉超，趙蕓，等.膠體金法和質(zhì)譜法檢測禽蛋中喹諾酮類殘留的比較［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2015，56（11）：1763－1766.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151119

2015?09?14

杭州市社會發(fā)展科研專項（20130533B24）

柳愛春（1972－），女，浙江永康人，高級工程師，本科，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測和相關的科研工作。E?mail：liuaichun01＠163.com。