劉瑩瑩 蘇碧麗 龐文生 胡娟

實驗研究

野葛、粉葛水煎液和醇提液中3種異黃酮成分含量的比較研究

劉瑩瑩 蘇碧麗 龐文生 胡娟

目的對野葛、粉葛飲片水煎液和醇提液中3種主要成分含量進行比較研究, 探討兩種葛根主要成分的差異。方法采用高效液相色譜法測定野葛和粉葛水煎液、乙醇提取液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的含量。結果野葛與粉葛相比, 無論在醇提液還是水煎液中, 野葛中的3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元這三個成分含量都高于粉葛。野葛水煎液中3’-羥基葛根素含量是野葛醇提液的6.63倍, 野葛水煎液中葛根素含量是野葛醇提液的3.49倍, 野葛水煎液中大豆苷元含量與野葛醇提液基本相同；但是在粉葛醇提液中這三個成分含量略高于水煎液。結論在醇提液和水煎液中,野葛的3種異黃酮成分含量均高于粉葛。

葛根為豆科葛屬野葛 Pueraria lobata (Willd.) Ohwi的干燥根, 習稱野葛。而葛根的另一來源豆科葛屬甘葛藤P. thomsonii Behth. 的干燥根, 稱為粉葛。兩者均載于《中國藥典》, 并廣泛應用于臨床。葛根味甘、辛、涼, 具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉之功效［1］。有文獻報道葛根的主要活性成分是3’-羥基葛根素、葛根素及大豆苷元等異黃酮類化合物［2-4］, 其具有降血壓、保肝、降血糖、降血脂、治療頸椎病等療效［5-7］。2010版藥典中葛根與粉葛的質量控制指標是測定葛根素含量［8］。多指標成分含量的同時測定是當今中藥質量控制的發(fā)展趨勢［9-11］。葛根乙醇提取液中多種成分的同時測定已有報道［12,13］, 但野葛、粉葛水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素及大豆苷元3種異黃酮成分的含量測定未見報道。中藥煎煮是中藥飲片臨床用藥的主要方式, 水煎液中有效成分的含量對中藥飲片發(fā)揮藥效起著至關重要的作用。本文采用高效液相色譜法同時測定葛根醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素、大豆苷元的含量, 對比野葛、粉葛三種異黃酮成分的差異, 評價其質量, 為葛根的臨床用藥提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜系統(tǒng),2998型二極管陣列檢測器, Empower3數據處理系統(tǒng)(美國 Waters 公司), KQ250E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), Milli-Q 超純水設備(美國 Millipore 公司), 濾膜(美國Millipore 公司, 孔徑0.45 μm)。

1.2 試劑與藥材 葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所, 批號：110752-201313)；3’-羥基葛根素對照品(成都普菲德生物技術有限公司, 批號：130416)；大豆苷元對照品(中國藥品生物制品檢定所, 批號：111502-200402)；野葛購自福建祥安藥業(yè)有限公司(上?？禈蛑兴庯嬈酚邢薰? 產地：四川, 批號：120509、120513、120520)；粉葛購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂(安徽源和堂藥業(yè)股份有限公司, 產地：廣西,批號：1202201、1202205、1202209)；乙醇(國藥集團化學試劑有限公司, 分析純), 甲醇、乙腈(德國 Merck 公司, 色譜純)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；檢測波長：250 nm；柱溫：30℃；對照品、醇提液、水煎液進樣體積分別為：10、20、6 μl；流速：1.0 ml/min；梯度洗脫程序見表1。在此色譜條件下各對照品和供試品色譜圖見圖1, 色譜圖中3個成分分離良好。

表1 梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備 樣品的測定方法參照《中國藥典》2010年版(一部)附錄Ⅵ D 高效液相色譜法外標法測定, 具體操作方法如下。

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元對照品1.66、1.65、2.06 mg, 分別用甲醇溶解,定容至5 ml, 得3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元對照品儲備液, 精密量取上述各溶液3 ml 置于容量瓶中, 搖勻, 作為3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元對照品溶液, 對照品濃度分別為0.11、0.11、0.14 mg/ml。

2.2.2 野葛和粉葛醇提液供試液的制備 取葛根(0.5 g)、粉葛(0.5 g)飲片粉末, 精密稱定, 分別置于具塞錐形瓶中, 精密加入30％乙醇50 ml, 超聲30 min, 放冷, 定容至50 ml, 然后搖勻, 濾過。取續(xù)濾液, 即得野葛和粉葛醇提液供試液,其生藥量分別為10.00、10.00 mg/ml。

2.2.3 野葛和粉葛水煎液供試液的制備 分別精密稱取野葛飲片和粉葛飲片50 g, 浸泡15 min, 分別加水煎煮2次(每次加水量為500 ml；每次煎煮時間為30 min), 趁熱用四層紗布濾過。合并濾液, 分別得到860、870 ml濾液, 即得野葛和粉葛水煎液供試品溶液, 其生藥量分別為58.14、57.47 mg/ml。

2.3 線性范圍考察 分別精密吸取上述混合對照品溶液0.01、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml, 置于10 ml容量瓶內,以甲醇定容至刻度, 經 0.45 μm 微孔濾膜過濾, 得3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元系列混合對照品溶液。按“2.1”項下方法測定。結果表明：3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的濃度在 0.11～27.50、0.11～27.50、0.14～0.35 μg/ml的范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗 取同一混合對照品混合溶液(3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的濃度分別為0.11、0.11、0.14 mg/ml),于同一天內連續(xù)進樣測定6次, 測得3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.67％、0.56％、0.83％, 日內精密度良好, 表明儀器較為穩(wěn)定。

2.5 重復性試驗 取同一批葛根飲片, 按“2.2”項下方法制備供試液溶液, 各平行6份。

按“2.1”項下色譜條件進樣測定, 分別記錄各色譜峰面積。計算得野葛醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的平均含量(n=6)分別為0.77％、2.87％、0.10％和0.23％、0.86％、0.86％, RSD依次為1.02％、1.32％、1.28％和1.09％、1.22％、1.27％；粉葛飲片和水煎液中葛根素和大豆苷元的平均含量(n=6)分別為0.653％、0.098％和0.077％、0.008％, RSD分別為1.34％、1.01％和0.64％、1.08％。結果表明該方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取野葛、粉葛醇提液供試品溶液和野葛、粉葛水煎液供試品溶液, 分別于1、2、3、4、8、12、24 h按“2.1”項下方法測定, 記錄峰面積。結果顯示, 野葛醇提液供試液日內穩(wěn)定性的RSD=0.48％ (n=6), 粉葛醇提液供試液日內穩(wěn)定性的RSD=0.29％ (n=6), 野葛水煎液供試液日內穩(wěn)定性的RSD=0.67％ (n=6), 粉葛水煎液供試液日內穩(wěn)定性的RSD=0.69％ (n=6), 表明表明野葛、粉葛醇提液供試液和野葛、粉葛水煎液供試液的穩(wěn)定性良好。

2.7 定量限和檢測限 將各對照品溶液梯度稀釋至一定濃度, 以信噪比3：1為檢測限(LOQ), 以信噪比10：1為定量限進行測定(LOD), 測得3’-羥基葛根素的定量限為45.3 ng/ml,檢測限為15.4 ng/ml；葛根素的定量限為73.5 ng/ml, 檢測限為21.4 ng/ml；大豆苷元的定量限為55.1 ng/ml, 檢測限為18.2 ng/ml。

2.8 計算方法 供試品的百分含量計算公式為：

公式中, AX為供試品的峰面積；AR為對照品的峰面積；mR為對照品的進樣質量；MX為供試品的進樣生藥量。

2.9 樣品測定 精密稱取3個批次的樣品, 分別按“2.2”項下方法制備野葛和粉葛醇提液供試液及水煎液供試品溶液, 各平行3次。按“2.1”項下色譜條件進樣測定, 計算野葛、粉葛醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元含量。測定結果見表2, 色譜圖見圖1。

表2 野葛、粉葛醇提液和水煎液中3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元的含量(n=3, ％)

3 討論

野葛和粉葛中雖主要含有3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元等異黃酮成分, 但兩個品種中各種異黃酮的含量具有一定差別, 本實驗結果顯示, 無論在醇提液還是水煎液中,野葛中的3’-羥基葛根素、葛根素和大豆苷元這三個成分含量都高于粉葛。野葛水煎液中3’-羥基葛根素含量是野葛醇提液的6.63倍, 野葛水煎液中葛根素含量是野葛醇提液的3.49倍, 野葛水煎液中大豆苷元含量與野葛醇提液相同；但是在粉葛醇提液中這三個成分含量略高于水煎液。粉葛中化學成分不僅在種類和含量上不如野葛, 而且其化學成分還較難融入到湯劑中, 這可能與粉葛富含淀粉, 水煮時, 淀粉粒易糊化, 在飲片表面形成保護膜, 有效成分不易煎出有關,故臨床使用葛根優(yōu)先選用野葛；但因粉葛栽培產量高, 并且富含淀粉, 適用于養(yǎng)生保健原料。

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Comparative study of three kinds of isoflavonoid in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii

LIU Ying-ying, SU Bi-li, PANG Wen-sheng, et al. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou350122, China

ObjectiveTo compare contents of three kinds of main elements in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii, and to investigate the main difference between the two kinds of pueraria lobata.MethodsThe contents of3’-hydroxy puerarin, puerarin, and daidzein in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii were detected by high performance liquid chromatography.ResultsPueraria lobata had higher contents of3’-hydroxy puerarin, puerarin, and daidzein in both ethanol extracts and decoction than pueraria thomsonii. The content of3’-hydroxy puerarin in decoction of pueraria lobata was6.63 times of that in ethanol extracts, and the content of puerarin in decoction of pueraria lobata was3.49 times of that in ethanol extracts. The content of daidzein in decoction of pueraria lobata was basically the same as that in ethanol extracts. The ethanol extracts of pueraria thomsonii had larger contents of the three elements than the decoction.ConclusionThe contents of three kinds of isoflavonoid in the decoction and ethanol extracts of pueraria lobata are higher than those of pueraria thomsonii.

Pueraria lobata; Pueraria thomsonii; Puerarin;3’-hydroxy puerarin; Daidzein

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.194

2014-11-26］

國家自然科學基金項目(項目編號：81274050)

350122 福建中醫(yī)藥大學

胡娟

【關鍵詞】野葛；粉葛；葛根素；3’-羥基葛根素；大豆苷元