陸浩　姚康　黃東　李晨光　常書福　戴宇翔　孫愛軍　鄒云增　錢菊英　葛均波

(復旦大學附屬中山醫(yī)院心內科，上海　200032)

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·論著·

ST段抬高型急性心肌梗死患者外周血中樹突狀細胞及其亞型的變化

陸浩姚康黃東李晨光常書福戴宇翔孫愛軍鄒云增錢菊英葛均波

(復旦大學附屬中山醫(yī)院心內科，上海200032)

摘要目的：探討ST段抬高型急型心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者外周血中樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)及其亞型的變化。方法： 選擇17例ST段抬高型AMI患者(AMI組)和14例穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris，SAP)患者(SAP組)為研究對象，并以15例性別、年齡相匹配的冠狀動脈造影陰性者為對照組。采用流式細胞技術三色分析法測定3組人群外周血中DCs及其亞型占外周血單個核細胞的百分比和絕對數(shù)，其中DCs以Lin1-HLA-DR+確定，髓樣樹突細胞(myeloid dendritic cell，mDC)以Lin1-HLA-DR+CD11c+確定，漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)以Lin1-HLA-DR+CD123+確定；并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測3組人群外周血中白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。其中ST段抬高型AMI患者在AMI發(fā)作7 d后進行隨訪。結果：AMI組患者急性期(<24 h)DCs占外周血單個核細胞的百分比、DCs的絕對數(shù)、mDC和pDC占外周血單個核細胞的百分比、mDC和pDC的絕對數(shù)、mDC與pDC比值均低于SAP組和對照組(P<0.01、0.05)。發(fā)作7 d后復查，AMI組DCs占外周血單個核細胞的百分比、DCs的絕對數(shù)、mDC和pDC占外周血單個核細胞的百分比、mDC和pDC的絕對數(shù)、mDC與pDC比值均高于急性期(P<0.01、0.05)。SAP組與對照組外周血中DCs占外周血單個核細胞的百分比、DCs的絕對數(shù)、mDC和pDC占外周血單個核細胞的百分比、mDC和pDC的絕對數(shù)、mDC與pDC比值差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AMI患者急性期血清TNF-α及IL-6水平高于對照組和SAP組(P<0.05)，發(fā)作7 d后IL-6水平明顯降低(P<0.05)。結論：AMI時外周血中的DCs包括mDC及pDC在急性期均明顯降低，發(fā)作7 d后恢復至正常水平，提示外周血中DCs在AMI急性期可能參與了不穩(wěn)定斑塊的形成。

關鍵詞樹突狀細胞；動脈粥樣硬化；免疫反應；ST段抬高型急型心肌梗死

炎性免疫反應在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的發(fā)生、演變及破裂過程中有至關重要的作用[1]。氧化型低密度脂蛋白、微生物抗原及熱休克蛋白等可誘發(fā)血管壁的免疫反應，從而導致AS的發(fā)生和進展。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)作為體內最重要的專職抗原呈遞細胞和免疫調節(jié)細胞，在這一過程中起了重要作用。目前研究[2]發(fā)現(xiàn)，DCs在不穩(wěn)定斑塊中的數(shù)量明顯增加，且DCs主要聚集于不穩(wěn)定斑塊的肩部，與T淋巴細胞成簇聚集啟動了炎性免疫反應，從而增加了斑塊不穩(wěn)定性。

目前在人外周血中發(fā)現(xiàn)至少2種DCs亞型：髓樣DC(myeloid DC，mDC)和漿細胞樣DC(plasmacytoid DC，pDC)。mDC來自骨髓樣前體細胞，可產(chǎn)生大量的白介素-12(IL-12)，促使Th1免疫應答；pDC起源于淋巴樣前體細胞，呈現(xiàn)漿細胞樣形態(tài)，可產(chǎn)生不依賴于IL-4的Th2免疫應答。DCs表達高水平的人類主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子，因此DCs的表型確定為Lin-HLA-DR+細胞[3]。在許多自身免疫性系統(tǒng)性疾病及慢性感染性疾病中，血液循環(huán)中的DCs數(shù)量明顯減少。研究[4-5]提示，DCs遷移至局部病灶及相鄰淋巴結組織是導致外周血DCs減少的原因。目前認為炎性免疫反應在不穩(wěn)定斑塊形成及破裂過程中起了重要作用，而急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是不穩(wěn)定斑塊破裂導致的。在AMI時，全身處于炎性免疫反應狀態(tài)，體內循環(huán)中DCs數(shù)量及其亞型的變化可反映此時體內炎性狀態(tài)及DCs功能變化。因此，本研究對不穩(wěn)定斑塊引起的極端狀態(tài)——ST段抬高型AMI患者外周循環(huán)中DCs數(shù)量及其亞型改變進行了研究，以探索DCs在不穩(wěn)定斑塊形成中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料本研究入選3組人群：(1)ST段抬高型AMI患者(AMI組)：2011年1月—4月復旦大學附屬中山醫(yī)院收治的17例發(fā)病時間在24 h內的ST段抬高型AMI患者，其中男性12例，女性5例，年齡46～74歲，平均(64.25±7.73)歲，其中15例患者行急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percuta-neous coronary intervention，PCI)；(2)穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris，SAP)患者(SAP組)：14例冠狀動脈造影證實至少一支冠狀動脈狹窄>50%、肌鈣蛋白T陰性、入院前24 h內無靜息性胸痛的患者，其中男性11例，女性3例，年齡52～75歲，平均(63.67±9.74)歲；(3)對照組：年齡、性別匹配的冠狀動脈造影陰性者15例，其中男性11例，女性4例，年齡50～75歲，平均(62.16±12.43)歲。排除標準：美國紐約心臟病學會(New Yoke Heart Association，NYHA)心功能分級3級和4級、肝腎功能不全、自身免疫性系統(tǒng)性疾病、感染性疾病(如敗血癥、嚴重的肺部或膽道感染、高熱等)、應用非甾體類消炎藥、惡性腫瘤、哮喘、卒中、周圍血管疾病等患者。

1.2標本采集AMI組患者入院當天采集靜脈血2 mL，其中行急診PCI術的患者術前采血，并在AMI發(fā)作7 d后再次采血。SAP組及對照組均采集入院24 h內清晨空腹靜脈血。所有入選者按常規(guī)方案測定白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-choleste-rol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)；并取患者血清，采用酶聯(lián)鏈免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)及白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)；流式細胞技術三色分析法檢測外周血DCs及其亞型比例。

1.3DCs及其亞型的檢測取4根試管，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的Lin1混合抗體20 μL和PerCP標記的HLA-DR單克隆抗體(美國Becton Dickinson公司)10 μL，同時管1、2、3、4分別加入熒光素(phycoerythrin，PE)標記的CD123、IgG1、CD11c和IgG2a單抗(美國Becton Dickinson公司)，第2、4管作為陰性對照。每管加入200 μL全血，振蕩混勻，室溫暗處反應20 min。加入熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)溶血素2 mL溶解紅細胞，振蕩混勻，室溫暗處放置10 min。1500 r/min離心5 min，棄去上清液后，振蕩混勻，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)；1500 r/min離心5 min，棄上清，振蕩混勻，加入300 μL 1%多聚甲醛；2～8 ℃暗處保存，24 h內。應用FACS流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)分析結果，流式細胞檢測方法及步驟見圖1，其中mDC以Lin1-HLA-DR+CD11c+確定，pDC以Lin1-HLA-DR+CD123+確定，總DCs=mDC+pDC。

A：排除細胞碎片和死細胞；B：找到Lin1弱陽性和陰性群體：使用Anti-HLA-DR/Lin1點圖(G1=R1)，畫R2，圈定Lin1弱陽性和陰性細胞；C：畫R3，圈定嗜堿粒細胞(Anti-HLA-DR-/CD123+)；畫R4，圈定CD123+DC細胞(Anti-HLA-DR+/CD123+)；pDC定義為HLA-DR+和CD123+(R4)；D：畫R5，圈定CD11c+細胞(Anti-HLA-DR+/CD11c+)；mDC定義為Lin-，HLA-DR+和CD11c+(R5)

圖1流式細胞儀檢測外周血DCs亞型

1.4血清TNF-α和IL-6的檢測采用雙抗體夾心ELISA法，按照試劑盒說明書進行。取血清100 μL加至預包被抗人TNF-α單抗的96孔酶標板中，37 ℃溫育60 min，棄待測樣品血清，Tween-PBS洗滌數(shù)次反應板(每孔加入350 μL)，并去除水滴；再加入100 μL生物素標記的抗人TNF-α的多克隆抗體，37 ℃溫育60 min，Tween-PBS洗滌數(shù)次；每孔加入100 μL辣根過氧化物酶，37 ℃溫育30 min，Tween-PBS洗滌數(shù)次；每孔加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色液，37 ℃暗處溫育15 min后，加入100 μL終止液，30 min內450 nm處讀取光密度(optical density，OD)值，根據(jù)同時測定的標準樣品曲線計算待測血清中TNF-α含量。同樣方法測定IL-6濃度。

2結果

2.1臨床資料3組人群的年齡、既往史(包括高血壓、糖尿病史及吸煙史)、實驗室檢查(包括TC、LDL-C、HDL-C、TG)和藥物(包括阿司匹林、血管緊張素轉化酶抑制劑/血管緊張素受體阻斷劑、他汀類藥物)應用情況見表1。

2.1AMI患者急性期外周血中DCs的變化AMI組患者急性期DCs占外周血單個核細胞的百分比、DCs絕對數(shù)均低于SAP組及對照組(P<0.01)；AMI患者發(fā)作7 d后DCs占外周血單個核細胞百分比及其絕對數(shù)與急性期比較明顯增加(P<0.01)；SAP組患者外周血中DCs占外周血單個核細胞的百分比及其絕對數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表1　3組人群的臨床資料比較　(n，%)

注：ACEI/ARB：血管緊張素轉化酶抑制劑/血管緊張素受體阻斷劑，與對照組比較，*P<0.05

表2　3組人群外周血中DCs的變化

注：與對照組及SAP組比較，*P<0.01；與AMI組急性期比較，△P<0.01

2.3AMI患者外周血中DCs亞型的變化AMI組急性期外周血mDC與pDC占外周血單個核細胞的百分比和其絕對數(shù)較SAP組及對照組均明顯降低(P<0.01)，SAP組外周血mDC與pDC占外周血單個核細胞的百分比及其絕對數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AMI組患者發(fā)作7 d后mDC與pDC占外周血單個核細胞的百分比及其絕對數(shù)較急性期均明顯增加(P<0.01)，見圖2及表3。

另外，AMI組急性期外周血mDC與pDC比值低于對照組和SAP組(P<0.05)，AMI組發(fā)作7 d后mDC與pDC的比值與急性期比較明顯上升(P<0.05)；SAP組患者外周血mDC與pDC比值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4AMI患者血清TNF-α及IL-6水平的變化與對照組及SAP組患者比較，AMI組急性期血清TNF-α及IL-6水平明顯上升(P<0.05)；發(fā)作7 d后血清IL-6的水平明顯下降(P<0.05)，而TNF-α水平未見明顯降低，見表4。

圖2流式細胞技術三色分析法檢測1例正常對照患者、1例穩(wěn)定性心絞痛(SAP)患者及1例急性ST段抬高型心肌梗死(AMI)患者外周血中的mDC[Lin-，HLA-DR+和CD11c+(R5)]及pDC[Lin-，HLA-DR+和CD123+(R4)]

表3　3組人群外周血中DCs亞型的變化

注：與對照組及SAP組比較，*P<0.01；與AMI組(急性期)比較，△P<0.01

表4　3組人群血清TNF-α及IL-6水平的變化

注：與對照組及SAP組比較，*P<0.05；與AMI組急性期比較，△P<0.05

3討論

在AS斑塊組織內有大量DCs聚集，DCs不僅參與了AS斑塊形成的過程，而且在不穩(wěn)定AS斑塊的形成中起了重要作用。在AS斑塊中，90%的DCs聚集在斑塊內有破裂傾向的肩部[2]。Yilmaz等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在不穩(wěn)定頸動脈斑塊肩部的DCs中，有70%表達其活化標志物CD83及樹突細胞溶酶體相關膜蛋白(DC-lysosomal-associated membrane protein，DC-LAMP)，并且在斑塊有破裂傾向的區(qū)域可發(fā)現(xiàn)激活的T淋巴細胞與DCs成簇聚集，因此認為DCs與T淋巴細胞在有破裂傾向的部位共聚集分布與斑塊的不穩(wěn)定性有關。研究[7]比較有和無急性缺血癥狀患者粥樣斑塊中DCs的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，急性缺血癥狀患者AS斑塊中DCs的數(shù)量明顯增多，并且不穩(wěn)定斑塊中的DCs是由循環(huán)中的DCs前體遷移而來。本研究利用流式細胞技術三色分析法直接測定ST段抬高型AMI患者外周血中DCs及其2種亞型mDC、pDC占外周血單個核細胞的百分比及其絕對數(shù)，并對mDC/pDC的比值變化進行分析，結果發(fā)現(xiàn)AMI患者急性期外周血mDC、pDC占外周血單個核細胞的百分比及其絕對數(shù)均明顯減小，mDC/pDC比值明顯下降，發(fā)作7 d后外周血中DCs數(shù)量及mDC/pDC比值逐漸恢復；并且發(fā)現(xiàn)AMI患者急性期血清IL-6、TNF-α明顯升高，發(fā)作7 d后IL-6水平下降，提示AMI患者急性期處于炎性免疫反應狀態(tài)。

DCs主要來源于骨髓中CD34+多能干細胞。DCs前體離開骨髓，隨著血液循環(huán)到達靶組織，定植到抗原侵入部位，并轉變?yōu)槌墒霥Cs；在這些部位，DCs持續(xù)而有效地攝取周圍微環(huán)境的抗原成分。黏附分子、共刺激分子和抗原呈遞分子的共同表達促進DCs與T淋巴細胞接觸并激活T淋巴細胞。在外周血中DCs數(shù)量很少(占外周血白細胞總數(shù)的0.1%～1%)。mDC來自骨髓樣前體細胞，與單核細胞和粒細胞有共同的祖細胞；mDC表面表達CD1c、CD11c、CD33；在TNF-α或CD40L刺激下，mDC遷移至外周組織中成為間質細胞并吞噬抗原，繼而通過二級淋巴器官激活免疫反應分泌IL-12，促使產(chǎn)生Th1免疫應答。pDC起源于淋巴樣前體細胞，呈漿細胞樣形態(tài)，與T、B和NK細胞有共同的前體細胞；pDC表達高水平IL-3受體α鏈(CD123)，是產(chǎn)生干擾素-α(interferon-α，IFN-α)的主要來源，還可產(chǎn)生不依賴于IL-4的Th2免疫應答。近期的研究[8-9]表明，mDC和pDC均在AS斑塊的形成和進展中起了重要作用。外周血中DCs的數(shù)量可以反映體內免疫狀態(tài)，本研究發(fā)現(xiàn)AMI患者急性期外周血中DCs數(shù)量明顯下降(以mDC下降更為明顯)，考慮可能有以下幾方面原因：首先，血液循環(huán)中的DCs可能遷移到AS斑塊中，造成外周血中數(shù)量的下降。如研究[10]發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈造影證實的冠心病患者外周血中pDC明顯下降，認為DCs遷移至AS斑塊組織是外周血DCs下降的原因。Yilmaz等[11]證實了這一點，他們發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定斑塊組織中巨噬細胞炎性蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α)的表達較穩(wěn)定斑塊內明顯增加，而MIP-3α是功能最強大的DCs趨化因子，在AS斑塊中MIP-3α與DCs數(shù)量明顯相關。Ranjit等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)，冠心病患者外周血中成熟mDC增加，遷移能力提高。本研究發(fā)現(xiàn)在AMI患者急性期血清TNF-α水平明顯增加，而TNF-α具有增加DCs與內皮細胞的黏附能力及促進DCs遷移的能力[13]。因此在AMI急性期，外周血中DCs在局部和外周炎性因子的趨化下，向不穩(wěn)定斑塊的遷移可能導致了外周血中DCs數(shù)量明顯減少，DCs在AS斑塊中聚集啟動并促進了炎性免疫反應，增加斑塊的不穩(wěn)定性，加速了斑塊破裂。其次，在AMI患者中，外周血中DCs遷移至淋巴結，而血管壁中的DCs在吞噬抗原后作為隱藏細胞通過傳入淋巴管遷移到淋巴組織，在那里激活T淋巴細胞，促進了炎性免疫反應過程。研究[14]發(fā)現(xiàn)，在AS斑塊血管周圍的淋巴結中的DCs數(shù)量明顯多于無AS斑塊血管周圍的淋巴結。再次，本研究發(fā)現(xiàn)在AMI患者發(fā)作7 d后外周血DCs數(shù)量基本恢復至正常水平，因此也不排除在急性期中外周血中DCs侵入壞死心肌造成外周血中DCs數(shù)量減少的可能。近期有研究[15]發(fā)現(xiàn)，在AMI急性期，梗死心肌組織中DCs的數(shù)量明顯增加。除此之外，不能排除其他原因引起的外周血中DCs數(shù)量下降，如骨髓中DCs前體細胞的產(chǎn)生減少、DCs細胞凋亡的增加等。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者急性期外周血mDC/pDC比值明顯下降，說明在AMI急性期mDC下降更明顯，更多mDC遷移至局部斑塊中。mDC和pDC對趨化因子的遷移反應存在明顯差別，前者對單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和MIP-3α敏感，后者主要被CXCR-12趨化[16]，而MCP-1和MIP-3α在AS斑塊和冠心病患者外周血中異常升高。盡管有研究表明，冠心病尤其是不穩(wěn)定型冠心病患者系統(tǒng)性免疫反應增強，表現(xiàn)為Th1應答增強，Th1應答相關細胞因子IL-12水平增高，但最近的研究更傾向于AS斑塊尤其是不穩(wěn)定斑塊局部的抗原依賴性免疫激活，而非系統(tǒng)性炎性免疫反應。DCs及其亞型在抗原遞呈和免疫應答的調節(jié)中發(fā)揮著重要作用，目前研究認為mDC和pDC的平衡是決定Th1/Th2免疫應答的關鍵，mDC可產(chǎn)生大量促炎因子IL-12而優(yōu)先誘導Th1應答，而pDC分泌少量的IL-12，主要產(chǎn)生Th2應答。本研究發(fā)現(xiàn)，外周血DCs遷移性改變，認為其可能是斑塊局部的免疫應答增強的重要原因，且以mDC的遷移為主，mDC在AS病變中受到抗原激活后，其分泌IL-12的能力增強，加速了Th1免疫應答，并可能導致AS斑塊的不穩(wěn)定性增加及破裂的發(fā)生。

本研究存在以下不足之處：研究入選的病例數(shù)少；對AMI患者僅隨訪7 d，應隨訪更長時間內患者外周血DCs數(shù)量的變化；在研究中未能對外周血中DCs的成熟度及其功能進行分析比較。另外本研究僅對DCs在外周血中數(shù)量變化進行研究，而DCs在冠心病中的作用尤其在AMI中的作用還需要經(jīng)病理及形態(tài)學研究來證實。

綜上所述，由不穩(wěn)定斑塊破裂導致冠狀動脈內血栓形成，是不穩(wěn)定斑塊引起的最終臨床表現(xiàn)。在AMI患者急性期，外周血中DCs數(shù)量明顯下降，可能遷移到了AS斑塊中并參與了斑塊不穩(wěn)定的形成，提示DCs在AS形成的炎性免疫過程起了重要作用，為AS炎性免疫假說提供了新的理論依據(jù)，并為AS尤其是不穩(wěn)定斑塊的預測提供了新的思路。

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The Alteration of Circulating Dendritic Cells and Subtypes in ST-Elevated Acute Myocardial Infarction

LUHaoYAOKangHUANGDongLIChenguangCHANGShufuDAIYuxiangSUNAijunZOUYunzengQIANJuyingGEJunboDepartmentofCardiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To analyze the frequency and alteration of circulating dendritic cells (DCs) and subtypes in patients with ST-elevated acute myocardial infarction(AMI). Methods:A total of 17 patients with ST-elevated AMI(AMI group) and 14 patients with stable angina pectoris(SAP) as SAP group and 15 people with normal coronary angiogram with matched age and gender(control group) were enrolled. The absolute number and percentage in peripheral blood mononuclear cells of circulating DCs, myeloid dendritic cell(mDC) and plasmacytoid dendritic cell(pDC) in the three groups were detected using the 3-colure staining flow cytometry.The levels of interleukin-6(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were detected with enzyme-linked immunosorbent assay.In the AMI group, these indexes were measured on the 7th day after the attack. Results: The percentage of circulating DCs in peripheral blood mononuclear cells and the absolute number of DCs, the percentage of circulating mDC and pDC in peripheral blood mononuclear cells and the absolute numbers of mDC and pDC and mDC/pDC ratio in the AMI group on the day of attack(<24 h) were significantly lower than those in the control group and the SAP group(P<0.01 or 0.05).In the AMI group,on the 7th day after the attack, the percentages of DCs,mDC and pDC in peripheral blood mononuclear cells and the absolute numbers of DCs,mDC and pDC and mDC/pDC ratio were higher than those on the day of attack (P<0.01 or 0.05).The level of IL-6 and TNF-α in the AMI group on the day of attack were significantly higher than those in the control group and SAP group(P<0.05), and the level of IL-6 decreased on the 7th day after the attack in the AMI group (P<0.05).But there was no significant difference in the percentage of DCs,mDC and pDC in peripheral blood mononuclear cells and the absolute numbers and mDC/pDC ratio between the control group and the SAP group(P>0.05). Conclusions: Circulating mDC and pDC are significantly reduced in patients on the day of attack of AMI,and it can increase to nearly normal on the 7th day after attack.It indicates that the possibility of DCs recruits into coronary plaques and improve the formation of unstable plaque.

Key WordsDendritic cells；Atherosclerosis；Immune response；ST-elevated acute myocardial infarction

通訊作者葛均波，E-mail：jbge@zs-hospital.sh.cn

基金項目：國家自然科學基金項目(編號：81400318)

中圖分類號R 542.2+2

文獻標識碼A