陳國(guó)平　曹大春　劉海林

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院消化科，上?！?00011)

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·論著·

新型mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的體外抑制作用

陳國(guó)平曹大春劉海林

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院消化科，上海200011)

摘要目的：探討新型mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的體外抑制作用。方法：體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株，給予不同濃度(0.1、1、10、25、50 nmol/L)的OSI-027處理，或以25 nmol/L OSI-027 處理0、24、48、72、96 h后，采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)觀察HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況；應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACS)及臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)OSI-027處理后HT-29細(xì)胞的凋亡和死亡情況；采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3和細(xì)胞色素C(cytochrome C)的表達(dá)。結(jié)果：OSI-027可抑制HT-29細(xì)胞的存活，且呈濃度和時(shí)間依賴性；還可抑制HT-29細(xì)胞的增殖，呈濃度依賴性；此外，OSI-027還能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞的凋亡和死亡，并呈濃度依賴性。OSI-027處理后，HT-29細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3和cytochrome C的表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論：新型mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞結(jié)腸癌；OSI-027；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；凋亡；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

結(jié)腸癌的發(fā)病率在我國(guó)惡性腫瘤中居第3位，且呈逐年上升趨勢(shì)[1]。以往常用于結(jié)腸癌治療的奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等藥物的不良反應(yīng)較嚴(yán)重，且易產(chǎn)生耐藥性[2]。

研究[3-5]證實(shí)，PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路在結(jié)腸癌等多種實(shí)體惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)及活化。PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路可以通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞凋亡等[3]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K)信號(hào)通路中位于蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)下游的重要分子，有2種復(fù)合物mTORC1和mTORC2，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖。

近年來(lái)篩選出的新型mTOR特異性激酶抑制劑OSI-027能阻斷mTORC1和mTORC2的活性[6]。本研究旨在觀察OSI-027對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的體外抑制作用。

1資料與方法

1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29及OSI-027均購(gòu)自德國(guó)Calbiochem公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)檢測(cè)試劑盒、DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、碘化丙啶(propidium iodine，PI)凋亡試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)所需的抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h更換一次培養(yǎng)液，3～4 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。OSI-027以DMSO溶解，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以等體積的0.1%DMSO作為對(duì)照。

1.2.3細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖將HT-29細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。給予不同濃度的OSI-027(0.1、1、10、25 nmol/L)或等體積DMSO處理8 d后，觀察直徑>50 μm集落的數(shù)目，并與對(duì)照組進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組直徑>50 μm集落的數(shù)目/對(duì)照組直徑>50 μm集落的數(shù)目×100%。

1.2.4流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將HT-29細(xì)胞接種于6孔板，每組3～4個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。給予不同濃度的OSI-027(1、10、25和50 nmol/L)或等體積DMSO處理72 h后，采用Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒鑒別細(xì)胞凋亡類型，其中，Annexin-V-FITC陽(yáng)性/PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，Annexin-V-FITC陽(yáng)性/PI陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，而Annexin-V-FITC陰性/PI陽(yáng)性的細(xì)胞為非凋亡細(xì)胞。每個(gè)樣本至少檢測(cè)20 000個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。計(jì)算Annexin-V-FITC陽(yáng)性細(xì)胞的比率，即為凋亡率。

1.2.5臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞死亡將HT-29細(xì)胞接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。給予不同濃度的OSI-027(1、10、25和50 nmol/L)或等體積DMSO處理，72 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，死亡細(xì)胞為臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。細(xì)胞死亡率=實(shí)驗(yàn)組臺(tái)盼藍(lán)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)取培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞，給予OSI-027(25 nmol/L)或等體積DMSO處理，24、48 h后，用RIPA裂解液提取HT-29細(xì)胞總蛋白并用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣30 μg蛋白，用6%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。加入1∶300的cleaved-caspase-3一抗和細(xì)胞色素C(cytochrome C)一抗后4 ℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)后室溫孵育2 h。顯色拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析進(jìn)行比較。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)結(jié)果OSI-027可抑制HT-29細(xì)胞的存活，且呈濃度和時(shí)間依賴性，見圖1~2。

與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1不同濃度OSI-027(處理72 h)對(duì)HT-29細(xì)胞

存活率的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖2OSI-027處理不同時(shí)間對(duì)HT-29細(xì)胞存活率的影響

2.2細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果OSI-027可抑制HT-29細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴性，見圖3。

2.3臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)結(jié)果OSI-027可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞的死亡，且呈濃度依賴性，見圖4。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果OSI-027可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞的凋亡，且呈濃度依賴性，見圖5。

2.5Western blotting法檢測(cè)結(jié)果OSI-027可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性，見圖6。

與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖3不同濃度OSI-027對(duì)HT-29細(xì)胞增殖率的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖4不同濃度OSI-027對(duì)HT-29細(xì)胞死亡率的影響

A：對(duì)照組與OSI-027組(藥物組)記錄細(xì)胞凋亡；B：藥物組早期凋亡細(xì)胞；C：藥物組晚期凋亡細(xì)胞；與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖5不同濃度OSI-027對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡率的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖6OSI-027對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3和cytochrome C表達(dá)的影響

3討論

PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路中的mTOR信號(hào)分子參與調(diào)控能量代謝和細(xì)胞增殖；mTOR的2個(gè)直接底物，即p70S6K和4E-BP-1是蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵因子[7]。mTOR的異?；罨谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用[7]。Ai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR能限制腫瘤細(xì)胞利用葡萄糖產(chǎn)生能量，阻止腫瘤細(xì)胞利用氨基酸合成新的蛋白質(zhì)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。最近有研究[9]發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑(rapamycin)可明顯減少淋巴瘤和白血病細(xì)胞的ATP生成，但Efeyan等[10]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)活化胰島素受體底物1(IRS-1)可負(fù)反饋活化存活通路Akt，抑制rapamycin及其類似物的療效；而且，rapamycin及其類似物還可負(fù)反饋活化的Erk/MAPK通路，進(jìn)一步限制其療效[11]。而OSI-027是一種新近研發(fā)的mTOR抑制劑，能阻斷2種mTOR復(fù)合物的活性，常被稱為mTORC1/mTORC2雙重抑制劑，具有阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)其分化和凋亡的能力[12]，從而達(dá)到抗腫瘤的效果。

本研究結(jié)果顯示，外源性添加的mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的死亡，抑制HT-29細(xì)胞的存活和增殖，且其作用與藥物濃度及作用時(shí)間相關(guān)。隨著OSI-027濃度的增加及作用時(shí)間的增加，對(duì)HT-29的細(xì)胞毒作用也逐漸增加。OSI-027還同時(shí)誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-3和cytochrome C蛋白的表達(dá)水平增加。

OSI-027阻斷HT-29細(xì)胞mTORC1和mTORC2的組裝和活化的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步明確。

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Inhibitory Effect of Novel mTORC1/mTORC2 Dual Inhibitor OSI-027 on Human Colon Cancer Cell Line HT-29 in Vitro

CHENGuopingCAODachunLIUHailin

DepartmentofGastroenterology,TheNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China

AbstractObjective： To investigate the inhibitory effect of novel mTORC1/mTORC2 dual inhibitor OSI-027 on human colon cancer cell line HT-29 in vitro.Methods： HT-29 cells, cultured in vitro，were either treated with different concentrations of OSI-027(0.1,1,10,25 and 50 nmol/L),or treated with 25 nmol/L OSI-027 for 0,24,48,72,96 h,respectively. Methyl thiazolyl tetrazolium assay(MTT) and cell colony forming assay were used to detect the growth and proliferation of HT-29 cells after treatment with OSI-027. Flow cytometry(FACS) and trypan blue staining were used to detect the influence of OSI-027 on apoptosis and death of HT-29 cells. Western blotting was used to detect the expression of apoptosis-related proteins cleaved-caspase-3 and cytochrome C.Results： OSI-027 inhibited the survival of HT-29 cells, and the inhibition was concentration and time dependent. It also inhibited the proliferation of HT-29 cells, and the inhibition was concentration dependent. It also induced apoptosis and death, and the inducement was concentration dependent.Expression levels of apoptosis-related proteins cleaved-caspase-3 and cytochrome C increased after OSI-027 treatment. Conclusions： The novel mTORC1/mTORC2 dual inhibitor OSI-027 can inhibit the proliferation of human colon cancer cell HT-29 and induce cell apoptosis.

Key WordsColon cancer；OSI-027；Mammalian target of rapamycin；Apoptosis；Signal transduction

中圖分類號(hào)R735.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

通訊作者劉海林，E-mail：liuhailin@medmail.com.cn