郭葉青，曾凡軍，趙必君，周媛媛，丁文柏，阮玉姝，熊曉琦,孟麗霞

(湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院&三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌　443003)

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miR-126抑制結(jié)腸癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的功能研究

郭葉青，曾凡軍，趙必君，周媛媛，丁文柏，阮玉姝，熊曉琦,孟麗霞

(湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院&三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌443003)

摘要：目的研究miR-126在體內(nèi)是否具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的功能。方法利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，將實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞分別進(jìn)行裸鼠皮下及尾靜脈成瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-126細(xì)胞系HCT116；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-126實(shí)驗(yàn)組皮下移植瘤瘤體平均體積明顯小于其對照組瘤體體積(P<0.05)；尾靜脈成瘤組中穩(wěn)定過表達(dá)miR-126實(shí)驗(yàn)組肺部轉(zhuǎn)移灶的平均數(shù)目、面積均明顯小于其對照組(P<0.05)。結(jié)論裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-126在體內(nèi)具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

關(guān)鍵詞：miR-126；結(jié)腸癌；慢病毒；增殖；侵襲轉(zhuǎn)移

結(jié)腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)每年大約新發(fā)100萬結(jié)腸癌患者，并且有50余萬患者因之而死亡。早期結(jié)腸癌病人通過手術(shù)治療預(yù)后較好，但是晚期病人的5年生存率僅有20%左右，治療效果不佳，其死亡的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移[1]。結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制非常復(fù)雜，這一過程涉及癌細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)換、侵襲黏附能力、血管生成、胞外基質(zhì)降解以及微環(huán)境趨化作用[2-3]。microRNA(miRNA)是長度約為19~24個(gè)核苷酸的一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，參與了基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。其作用機(jī)制是通過與靶mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’untranslational region，3’UTR)完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合，使靶mRNA直接發(fā)生降解或者抑制其翻譯，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。

已有大量研究證實(shí)miR-126是腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移抑制基因[5-6]，為了研究miR-126在體內(nèi)是否具有抑制結(jié)腸癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的作用，本研究利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，進(jìn)行裸鼠皮下、尾靜脈成瘤等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究miR-126在體內(nèi)是否能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。

1材料和方法

1.1材料慢病毒過表達(dá)載體pGIPZ、慢病毒膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pLTR-G、慢病毒包裝質(zhì)粒pCD/NL-BH，均購買于Addgene公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒購自Invitrogen公司；U6 and hsa-mir-126 snRNA Realtime PCR試劑盒購自上海吉瑪公司；基因合成及測序由上海生工生物公司完成；人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫；實(shí)驗(yàn)用裸鼠購自長沙斯萊克斯公司，為4周齡雄性裸鼠，SPF級，許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004。

1.2方法

1.2.1穩(wěn)定過表達(dá)miR-126結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的構(gòu)建自miRBase中找到hsa-miR-126序列，在Primer 引物設(shè)計(jì)軟件中將該段序列向上游、下游延伸大約100 bp設(shè)計(jì)PCR引物，并于末端引入保護(hù)堿基、Xho I 、BamH I酶切位點(diǎn)，序列如下：Hsa-miR-126-Xho I-F：CAACAGAAGGCTCGAGGGCAGGTTGCCCGGAGC;Hsa-miR-126-BamH I-R： ATTCTGATCAGGATCCCGCCTAAGTACGTCGGGGC。

以人的正常gNDA為模板， hsa-miR-126-BamH Ι-R、hsa-miR-126-Xho Ι-F為引物，擴(kuò)增has-miR-126的前體pre-miR-126序列，膠回收PCR產(chǎn)物。用BamH I、Xho I對過表達(dá)載體pGIPZ進(jìn)行酶切，將pre-miR-126序列連接入過表達(dá)載體pGIPZ，轉(zhuǎn)化Dh5a感受態(tài)，挑取克隆進(jìn)行菌落的PCR鑒定，接種陽性的克隆。華大基因公司測序結(jié)果證實(shí)插入的序列為pre-miR-126序列，接種并抽提質(zhì)粒。抽提質(zhì)粒后利用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，收集病毒液進(jìn)行濃縮、滴度測定。然后將包裝好的穩(wěn)定過表達(dá)miR-126實(shí)驗(yàn)組及對照組慢病毒感染HCT116細(xì)胞，流式細(xì)胞儀篩選純化GFP陽性的被感染結(jié)腸癌細(xì)胞，即得到穩(wěn)定過表達(dá)miR-126實(shí)驗(yàn)組及對照組結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116。抽提過表達(dá)miR-126實(shí)驗(yàn)組及對照組結(jié)腸癌細(xì)胞總RNA，行RNA質(zhì)檢后進(jìn)行U6及miR-126的逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行RT-PCR檢測過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-126的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):①逆轉(zhuǎn)錄體系：RT-Primer 1 μL，Template RNA 4 μg，dNTPs 1 μL，RNase-free water up to 12 μL，65℃ 5 min，立即置于冰上；RNase Inhibitor 1 μL，DTT 2 μL，5×buffer 4 μL，37℃ 2 min，MMLV 1 μL；②逆轉(zhuǎn)錄程序：37℃ 50 min， 70℃ 15 min。

(2) RT-PCR:①反應(yīng)體系：10×miScript Primer 0.4 μL，2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，RNase-free water 7.4 μL，Taq DNA Polymerase 0.2 μL；②realtime PCR程序：95℃ 3 min，95℃12 s，62℃ 50 s，后兩步為40個(gè)循環(huán)。

1.2.2裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)(1) 4周齡雄性裸鼠12 只，隨機(jī)分成兩組，培養(yǎng)穩(wěn)定過表達(dá)miR-126細(xì)胞株HCT116和對照組細(xì)胞株，按照每只裸鼠5×106個(gè)細(xì)胞，每只裸鼠注射0.2 mL細(xì)胞懸液于裸鼠右側(cè)腋下皮下;(2)計(jì)算腫瘤體積(V)，V=L×W2×0.52，計(jì)算兩組皮下移植瘤大小并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3裸鼠尾靜脈成瘤實(shí)驗(yàn)(1)將12只4周齡雄性裸鼠隨機(jī)分成兩組， miR-126穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系HCT116實(shí)驗(yàn)組及對照組；(2)培養(yǎng)穩(wěn)定過表達(dá)miR-126細(xì)胞株HCT116和對照細(xì)胞株，按照每只裸鼠1×106個(gè)細(xì)胞，用1 mL注射器每只注射0.2 mL 細(xì)胞懸液于裸鼠尾靜脈；(3)注射后密切觀察裸鼠的生長情況， 50 d后處死所有裸鼠，取其肺臟、肝臟、脾臟石蠟包埋，再切片行HE染色，若發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，則計(jì)數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目，并計(jì)算腫瘤轉(zhuǎn)移灶的面積，然后對兩組裸鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1穩(wěn)定過表達(dá)miR-126結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的構(gòu)建

2.1.1穩(wěn)定過表達(dá)miR-126質(zhì)粒的構(gòu)建(1) PCR擴(kuò)增miR-126前體序列：PCR擴(kuò)增得到大小為319 bp的產(chǎn)物(圖1)。

注：1.PCR產(chǎn)物；2.DNA marker。

(2)過表達(dá)載體pGIPZ的線性化：回收miR-126前體，然后用BamH I、Xho I酶對過表達(dá)載體pGIPZ行雙酶切，酶切后進(jìn)行電泳，回收大小約11 kb產(chǎn)物(圖2)。

(3)菌落的PCR鑒定 陽性克隆可以得到大小為715 bp的條帶，陰性克隆則得到434 bp條帶(圖3)。

(4)陽性克隆的測序：接種陽性轉(zhuǎn)化子后，取100 μL菌液測序，測序結(jié)果示過表達(dá)載體pGIPZ中插入的目的序列與miR-126的前體序列一致(圖4)。

2.1.2慢病毒包裝將過表達(dá)載體pGIPZ-miR-126(對照組為pGIPZ空質(zhì)粒)、膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pLTR-G、慢病毒包裝質(zhì)粒pCD/NL-BH共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于48 h后觀察熒光表達(dá)，293T細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)明顯，證實(shí)慢病毒的包裝成功。

注：1.DNA marker；2.pGIPZ酶切產(chǎn)物。

注：1.DNA Marker；2~9.挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子；10.空載體；11.H2O。

2.1.3穩(wěn)定過表達(dá)miR-126慢病毒感染HCT116后的熒光表達(dá)將過表達(dá)miR-126慢病毒pGIPZ-miR-126及pGIPZ空質(zhì)粒的對照病毒液按MOI=50加入HCT116細(xì)胞培基中，培養(yǎng)48～72 h后于熒光顯微鏡下觀察，可見HCT116細(xì)胞中有綠色熒光，證明慢病毒感染HCT116細(xì)胞成功，下文中用HCT116+pGIPZ-miR-126表示轉(zhuǎn)染了過表達(dá)miR-126質(zhì)粒pGIPZ-miR-126的HCT116細(xì)胞，用HCT116+pGIPZ表示轉(zhuǎn)染了pGIPZ對照質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞。將流式細(xì)胞儀分選后的HCT116+pGIPZ-miR-126、HCT116+pGIPZ擴(kuò)大培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光表達(dá)(圖5)。

注：A、C無熒光，B、D有熒光。

2.1.4Realtime PCR檢測miR-126過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組中的表達(dá)Realtime PCR的結(jié)果顯示：在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中miR-126的表達(dá)為對照組的5.08倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.1.5裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6分別為miR-126過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組裸鼠，利用公式V=L×W2×0.52計(jì)算皮下移植瘤瘤體體積(V)，對兩組裸鼠皮下移植瘤的體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，miR-126過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組(HCT116+pGIPZ-miR-126)裸鼠皮下腫瘤平均體積為(743.81±70.15)mm3，miR-126過表達(dá)對照組(HCT116+pGIPZ)裸鼠皮下移植瘤平均體積為(1 413.10±150.16)mm3，對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

A.過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組B.過表達(dá)對照組

圖6HCT116+pGIPZ-miR-126及

HCT116+pGIPZ皮下成瘤組裸鼠

2.1.6裸鼠尾靜脈成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果將顯微鏡下觀察到的轉(zhuǎn)移腫瘤癌的數(shù)目及面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示miR-126過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的平均轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目為4個(gè)，其對照組的平均腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目為9個(gè)，P<0.05；過表達(dá)miR-126實(shí)驗(yàn)組腫瘤轉(zhuǎn)移灶的平均面積為(0.26±0.03)mm2，其對照組的腫瘤轉(zhuǎn)移灶平均面積為(0.51±0.04)mm2，P<0.05(圖8)。

AB

圖8HCT116+pGIPZ-miR-126及HCT116+pGIPZ

尾靜脈組裸鼠肺HE染色(40×)

注：A.過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組；B.過表達(dá)對照組;實(shí)驗(yàn)組與對照組轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及面積比較，P<0.05。

3討論

MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，它通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)完全或不完全互補(bǔ)在轉(zhuǎn)錄后的水平調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，人類miRNA基因有一半以上定位于腫瘤相關(guān)基因區(qū)域或脆性位點(diǎn)，這個(gè)區(qū)域時(shí)常發(fā)生染色體片段的易位、異常擴(kuò)增、缺失[7]。目前已有大量研究證實(shí)miRNA的異常表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中包括miR-17、miR-19a、miR-21、miR-34a、miR-143和miR-145等[8-10]。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116+pGIPZ-miR-126及對照組細(xì)胞HCT116+pGIPZ，進(jìn)行裸鼠皮下、尾靜脈成瘤等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究miR-126在體內(nèi)是否能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。

慢病毒(lentivirus)是一種RNA病毒，因其病毒粒子中含有逆轉(zhuǎn)錄酶，故又稱逆轉(zhuǎn)錄病毒。慢病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后能以自身RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下生成互補(bǔ)DNA，然后以此互補(bǔ)DNA為模板來合成雙鏈的DNA，雙鏈DNA經(jīng)環(huán)化后在病毒整合酶的作用下可整合到宿主細(xì)胞的染色體上長期地表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)用穩(wěn)定過表達(dá)miR-126慢病毒pGIPZ-miR-126及對照組慢病毒pGIPZ空質(zhì)粒感染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系，感染后通過流式細(xì)胞儀篩選純化被感染細(xì)胞(GFP陽性細(xì)胞)，純化后擴(kuò)大培養(yǎng)并使用RT-PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞中miR-126的表達(dá)，結(jié)果顯示在HCT116 +pGIPZ-miR-126組中miR-126的表達(dá)為HCT116+pGIPZ組的5.08倍，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系構(gòu)建成功。

目前的結(jié)腸癌動(dòng)物模型可分為誘發(fā)性、自發(fā)性、轉(zhuǎn)基因性及移植性動(dòng)物腫瘤模型。其中移植瘤模型的成功率高、建立周期較短、生物學(xué)性狀穩(wěn)定，能滿足腫瘤的生物學(xué)研究而被廣泛應(yīng)用。已有大量研究報(bào)道m(xù)iR-126在肺癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌的作用。Zhu等[12]研究報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中過表達(dá)miR-126后，可通過抑制VEGFA基因的表達(dá)而發(fā)揮抑制肺癌細(xì)胞的增殖。Yu等[13]實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-126可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。本研究使用穩(wěn)定過表達(dá)miR-126和其對照組結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116注射于4周齡裸鼠右側(cè)腋下，比較各組皮下移植瘤的體積的大小，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-126實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下移植瘤體積明顯小于其對照組皮下移植瘤體積，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明miR-126具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖作用。

另已有多項(xiàng)研究證實(shí)miR-126與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。Sasahira等[14]證實(shí)miR-126可通過負(fù)調(diào)控VEGF基因的表達(dá)而抑制口腔癌細(xì)胞的遷移、侵襲，發(fā)揮著抑癌基因的作用。Frampton等[15]報(bào)道m(xù)iR-126可通過抑制其靶基因ADAM9的表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌細(xì)胞系進(jìn)行裸鼠尾靜脈成瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示miR-126過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組裸鼠的肺臟均發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，且統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示miR-126過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組肺臟內(nèi)的轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目和面積均低于其對照組(P<0.05)，證實(shí)了miR-126可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-126在體內(nèi)具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用，有可能成為有潛力的結(jié)腸癌診治新靶點(diǎn)。

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Suppression of proliferation and metastasis of colon cancer by miR-126

GUO Ye-qing，ZENG Fan-jun,ZHAO Bi-jun,et al

(YichangCentralHospital&TheFirstClinicalMedicalFacultyof

ThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443003,China)

Abstract:ObjectiveTo study the function of miR-126 in suppression of proliferation and metastasis of colon cancer in vivo.MethodsWe constructed stable overexpression of miR-126 colon cancer cell line HCT116 with lentiviral vector,and executed subcutaneous tumor formation and tail vein tumor formation test in nude mice with stable overexpression miR-126 colon cancer cell lines.ResultsStable overexpression of miR-126 cell line HCT116 was successfully constructed.Nude mice tumor formation experiment results showed that the mean tumor volume of overexpression of miR-126 in experimental group was significantly less than the tumor volume in control group(P<0.05).Tail vein tumor formation experiment results showed that the average number and size of lung metastases of overexpression of miR-126 in experimental group was significantly less than those in control group.ConclusionsNude mice tumor formation experiment results confirm that miR-126 can inhibit colon cancer cell＇s proliferation and metastasis in vivo.

Key words:miR-126;colon cancer;lentiviral vector;proliferation;metastasis

(收稿日期：2014-07-15，修回日期：2014-09-25)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.03.009