姚紅銳，龍子江，趙　剛 ，楊　燕 ，江　震

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，安徽 合肥　230031;2.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥　230012)

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毛菊苣有效部位降脂作用及初步機制探討

姚紅銳1，龍子江2，趙剛1，楊燕1，江震1

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，安徽 合肥230031;2.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥230012)

摘要：目的在整體水平上，研究毛菊苣有效部位含藥血清降脂作用及初步機制 。方法利用MTT法確定血清的加入量以及尼羅紅染色建立HepG2細胞高脂模型，在此基礎上，檢測細胞內的關鍵性指標甘油三酯(TG)和脂滴的含量,最后通過ELISA酶聯免疫吸附法分別從游離脂肪酸的吸收、氧化、TG 的合成方面對毛菊苣降脂有效部位含藥血清的降脂機制進行初步的探討。結果通過MTT實驗和尼羅紅染色及流式定量分析表明，脂肪乳濃度為總體積的 6%時，造模組細胞內的脂滴含量較正常對照組明顯增加，具有顯著性差異(P<0.01、0.001)；不同模型的大鼠含藥血清均可顯著性地降低HepG2細胞內TG(P<0.05)和脂滴(P<0.01、0.001)的含量，并且正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的含藥血清降脂效果顯著；同時對TG合成、氧化、吸收通路中的關鍵酶GPAT1-2(P<0.05)、PPARγ(P<0.05 、0.01)、FATP5(P<0.01)三個指標上的檢測表明正常狀態(tài)下的含藥血清與高脂模型組相比具有顯著性差異。 結論大鼠病理狀態(tài)下(高脂模型)與正常生理狀態(tài)下的毛菊苣降脂有效部位含藥血清具有顯著性地降低人肝癌HepG2細胞高脂模型的作用，并且后者較前者降脂效果明顯，其機制可能與減少GPAT1-2的含量、促進PPARγ的表達和抑制FATP5的生成有關。

關鍵詞：毛菊苣；有效部位；含藥血清；降脂作用；初步機制

傳統(tǒng)維吾爾醫(yī)用菊苣屬植物毛菊苣(CichoriumglundulosumBoissetHout)，在臨床上主要用于抗肝炎等作用，研究表明其在降脂方面亦有明顯的療效[1]。甘油三酯(TG) 和細胞內脂滴含量的多少直接反映了機體內脂質水平的高低。已知甘油脂類合成主要受線粒體外膜上的 GPAT1-2(mtGPAT )催化。研究發(fā)現過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)能夠增強脂肪酸的氧化和利用。在機體當中，還存在著另一類與游離脂肪酸吸收高度相關的蛋白，游離脂肪酸轉運蛋白(FATP5)，可特異性地介導脂肪酸的跨膜轉運。

因此，本文從整體水平上探討毛菊苣的降脂有效部位中潛在活性物質及其代謝產物的降脂作用[2-3],研究大鼠病理狀態(tài)下(高脂模型)與正常生理狀態(tài)下的毛菊苣降脂有效部位含藥血清對人肝癌HepG2細胞高脂模型的降脂作用，并且對這兩種血清降脂作用進行比較。同時分別從游離脂肪酸的吸收，氧化，TG 的合成方面，對毛菊苣降脂有效部位含藥血清的降脂機制進行初步的探討[4-5]。

1材料

1.1細胞人肝腫瘤細胞系 HepG2(ATCC)購自中科院上海藥物研究所。

1.2藥品與試劑毛菊苣有效部位物含藥血清(95%乙酸乙酯提取)[6]；尼羅紅(Sigma)；甘油三酯試劑盒(南京建成生物有限公司)；20%脂肪乳注射液(三菱制藥有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)；線粒體提取試劑盒(北京索寶來公司)；PPARγ、GPAT1-2、CD36、FATP5 ELISA 試劑盒(武漢優(yōu)爾生物技術有限公司)；高脂飼料(江蘇省協同醫(yī)藥生物工程有限責任公司)。

2方法

2.1MTT法確定血清加入量將 HepG2細胞以每孔8 000個的數目加入 96 孔板中，貼壁培養(yǎng) 24 h，隨后更換無血清培養(yǎng)基，同時分別加入不同體積的大鼠溶劑對照組血清，使其含量占總培養(yǎng)基的 5%、10%、20%、40%、60%。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，加入 20 μL MTT，培養(yǎng) 4 h，取出孔內所有液體，加入 150 μL DMSO，振搖 8～10 min，待顏色穩(wěn)定后，于510 nm處測定各孔吸光值，取平均值進行計算。

2.2細胞高脂模型的建立[7]取對數生長期的 HepG2細胞，以每孔 2×104的數目加入到 24 孔板當中，培養(yǎng) 24 h，待 HepG2細胞長到 60%～70% 時，加入脂肪乳注射液，使其終濃度分別為 0、2%、4%、6%、8%(v/v)，同時更換成無血清培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng) 24 h 后棄上清液，清洗加入尼羅紅染色液，室溫避光染色 5 min，PBS 洗滌 2 次，可直接在530～550 nm處通過熒光顯微鏡觀察測定。

2.3GPO-POD法檢測 HepG2細胞內 TG 的含量取對數生長期的 HepG2細胞，以每孔 1×105的數目加入到 6 孔板當中。細胞培養(yǎng) 24 h 后，棄上清，將細胞分為正常對照組、細胞高脂模型組，細胞高脂模型+各種含藥血清組，取上清，部分上清用于 BCA 法進行蛋白定量，剩余上清根據 TG 試劑盒說明書進行 TG 含量的測定。

取對數生長期的 HepG2細胞，以每孔 1×105的數目加入到 6 孔板當中。細胞培養(yǎng) 24 h 后，棄上清，將細胞分為正常對照組、高脂模型組，高脂模型+各種含藥血清組，用流式細胞儀檢測各組細胞熒光強度值，取熒光強度幾何中位值進行數據分析。降低率=(含藥血清平均熒光強度-正常血清平均熒光強度)/ 含藥血清平均熒光強度。

2.4ELISA 法檢測大鼠肝細胞線粒體內GPAT1-2的含量大鼠組織樣本處理后按照GPAT ELISA 試劑盒說明書操作，在酶標儀 450 nm處測 OD，15 min 內檢測，確定包被 ELISA 孔的線粒體濃度。

2.5ELISA 法檢測 HepG2細胞內PPARγ、FATP5的含量建立HepG2細胞高脂模型并給藥，用 ELISA 法在 450 nm 波長測量各孔的光密度(OD 值)，計算各組 PPAPγ、FATP5 的含量。

3結果

3.1MTT法確定血清加入量對HepG2細胞增殖的影響根據圖1結果，發(fā)現當大鼠溶劑對照組血清的加入量占培養(yǎng)基總量的 5%～20%時，不會抑制細胞的生長，故在以后的實驗當中，選擇血清藥理學通法中建議的10%為大鼠血清的加入體積比。

3.2HepG2細胞高脂模型的建立根據圖 2 結果，發(fā)現 HepG2細胞內的脂滴含量隨著脂肪乳濃度的增加而增加，當脂肪乳濃度達到總體積的 8% 時，細胞形態(tài)發(fā)生變化，故選擇 6%加入量為后續(xù)實驗中 HepG2細胞高脂模型造模濃度。圖3結果表明，在脂肪乳濃度為總體積的 6%時，造模組細胞內的 TG 含量較正常對照組明顯增加，具有極顯著差異(P<0.001 )。

A0%脂肪酸B2%脂肪酸C4%脂肪酸D6%脂肪酸E8%脂肪酸

圖2尼羅紅染色觀察HepG2細胞中不同組別的脂滴含量(400×)

注：箭頭所示為細胞的脂滴。

圖3HepG2細胞中正常組和模型組甘油三酯

注：與正常組比較，**P<0.01 ，***P<0.001。

3.3大鼠含藥血清對HepG2細胞高脂模型中TG含量的影響與同組溶劑對照血清相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均能顯著降低 HepG2細胞內 TG 的含量(P<0.05 )，并且正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的含藥血清降脂效果稍強，但彼此沒有顯著性差異。見表1。

表1　大鼠含藥血清對不同模型的HepG2細胞

注：與對照組比較，*P< 0.05。

3.4大鼠含藥血清對HepG2細胞高脂模型中脂滴含量的影響與同組溶劑對照血清相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均能顯著降低細胞內的脂滴含量(P<0.01，P<0.001)，并且正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的含藥血清的降脂滴作用更顯著。見表2。

表2　大鼠含藥血清對不同模型的HepG2 細胞

3.5大鼠含藥血清對大鼠肝細胞線粒體內GPAT1-2含量的影響由圖 4 得知，與線粒體模型組相比，陽性藥 NEM 與兩種狀態(tài)下的含藥血清均可以顯著性的降低大鼠肝臟線粒體中的 GPAT1-2的含量(P<0.05)；正常組大鼠溶劑對照血清也可以顯著的降低大鼠肝臟線粒體中 GPAT1-2的含量(P<0.05)，說明大鼠含藥血清可明顯減少肝線粒體內GPAT1-2的含量。

注：與模型組比較，*P< 0.05。

3.6大鼠含藥血清對HepG2細胞高脂模型中PPARγ含量的影響結果見圖5，與正常組比較，高脂模型組PPARγ含量顯著降低(P<0.01)；與細胞高脂模型組相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均可以顯著性的升高 HepG2細胞高脂模型中 PPARγ 的含量(P<0.05、0.01)，說明大鼠含藥血清可明顯促進PPARγ含量的表達。

圖5正常大鼠與高脂大鼠含藥血清對PPARγ表達的

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.7大鼠含藥血清對HepG2細胞高脂模型中FATP 5含量的影響結果見圖6，與正常組比較，高脂模型組FATP 5含量顯著升高(P<0.01)；與細胞高脂模型組相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均可以顯著性的降低 HepG2 細胞高脂模型中FATP 5 的含量(P<0.01)，說明大鼠含藥血清可明顯地抑制FATP 5含量的表達。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P< 0.01。

4討論

結果顯示，在 TG 與細胞內脂滴這兩種代表細胞內脂質含量的終點檢測指標方面，正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的血清降脂效果略強，這可能表明病理狀態(tài)下機體確實對含藥血清當中的有效成分有一定程度消耗；由實驗結果發(fā)現，高脂組含藥血清也能明顯的改善 HepG2細胞中脂質的蓄積，這說明在高脂組含藥血清當中，也存在著一些由于藥物刺激而產生的降脂活性物質[8-9]。

從 GPAT1-2、 PPARγ和 FATP5 這 3個與 TG 的合成、FFA的氧化和吸收有關的指標來看，兩種狀態(tài)下的血清都有明顯的恢復作用，并且彼此之間沒有差別，說明在一般情況下，兩種模型的含藥血清都可以進行血清藥理學研究[10]。此外，在 GPAT1-2和 FATP5 這 2 個指標當中，發(fā)現溶劑對照組血清與模型組相比，也有明顯的保護作用，說明血清內本身就含有多種生物活性因子，從而對機體起到一定的保護作用。

在本實驗當中，發(fā)現毛菊苣降脂有效部位的含藥血清能夠降低細胞內脂質的含量，同時也能顯著性的改善由于細胞高脂模型所引起的脂質代謝相關靶點的紊亂，說明毛菊苣降脂有效部位能夠從整體上，多角度的調節(jié)脂類的生成與代謝，為毛菊苣的降脂物質基礎以及作用機制的進一步研究提供一點依據[11-12]。

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Lipid-lowering effect of the effective parts of Cichorium glundulosum

and its preliminary mechanism

YAO Hong-rui1,LONG Zi-jiang2,ZHAO Gang1,et al

(1.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,

Hefei230031,China;2.DepartmentofPharmacy,AnhuiUniversityofTCM,Hefei230012,China)

Abstract:ObjectiveTo explore lipid-lowering effect of the effective parts of Cichorium glundulosum and its preliminary mechanism.MethodsMTT method was used to determine the amount of serum,as well as Nile red staining to establish hyperlipidemia model of HepG2cells.On this basis,the content of key index TG and the lipid droplets were determined.Finally,ELISA enzyme-linked immunosorbent assay was used to make a preliminary study of the lipid-lowering mechanism of Cichorium glundulosum effective parts from the aspects of the absorption,oxidation and TG synthesis of free fatty acid.ResultsIt was showed that,through MTT experiment and Nile red staining and the flow type quantitative analysis,fat drops content of module cell was obviously increased more than that of control group and had significant difference (P< 0.01 and 0.001) when fat breast concentration was 6% of the total volume;content of TG (P<0.05) and fat drops (P<0.01 and 0.001) of HepG2cells were significantly reduced in different models of rat,and medicated serum in normal state had more significant lipid-lowering effect than that in pathological state.And tests of the three indexes GPAT1-2(P<0.05),PPARγ (P<0.05 and 0.01),FATP5(P<0.01) showed that there was significant difference between medicated serum in normal state group and that in high lipid model group.ConclusionsMedicated serum with the effective parts of Cichorium glundulosum in pathological state (high lipid model) or in normal state can both significantly lower hyperlipidemia model of human hepatoma cell line HepG2cells and the latter had more significant lipid-lowering effect,the mechanism of which may be related to reducing the content of GPAT1-2,promoting the expression of PPARγ and inhibiting the FATP5 generation.

Key words:Cichorium glundulosum;effective parts;medicated serum;lipid-lowering effect;preliminary mechanism

(收稿日期：2015-05-30，修回日期：2015-07-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.10.006

通信作者：龍子江，男，教授，博士生導師，研究方向：中藥及復方藥理作用及機制研究，E-mail：942615693@qq.com

基金項目：安徽高校省級自然科學研究項目 (No KJ2014Z150)