霍忠超，劉曉霞，王雪玲，陳劍華，蘇英

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負(fù)載肺癌全抗原的自體樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的體外研究

霍忠超，劉曉霞，王雪玲，陳劍華，蘇英

目的 在體外研究負(fù)載肺癌全抗原的自體樹突狀細(xì)胞(DCs)誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒作用。方法 肺癌組織、正常肺組織和外周血新鮮標(biāo)本均取自肺鱗狀細(xì)胞癌并行手術(shù)治療的7例患者，肺癌組織和正常肺組織制備為單細(xì)胞懸液。自外周血分離單核細(xì)胞并誘導(dǎo)DCs，尼龍毛柱法分離T細(xì)胞。凍融法制備自體肺癌細(xì)胞裂解液，并刺激DCs，制備負(fù)載自體肺癌全抗原的DCs。MTS法檢測負(fù)載肺癌全抗原的DCs對T細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)測定DCs表型及負(fù)載肺癌全抗原的DCs對T細(xì)胞細(xì)胞毒作用的影響。結(jié)果 外周血單核細(xì)胞經(jīng)GM-CSF、IL-4和TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)后，在細(xì)胞膜上出現(xiàn)大量的樹突狀突起，表面分子CD14表達(dá)顯著降低(t=20.157，P<0.01)，CD1a、CD11c、CD80、CD83和HLA-DR表達(dá)明顯增加(t=8.927，3.042，14.311，18.537，5.612，P<0.05，P<0.01)，獲得負(fù)載肺癌全抗原的成熟DCs；其能刺激自體T細(xì)胞增殖，不同患者刺激指數(shù)不同為6.98～39.15(21.56±4.38)，而且DC/T比率越高，刺激指數(shù)越高，T細(xì)胞增殖反應(yīng)能力越強(qiáng)(t=31.203，19.550，P<0.01)；負(fù)載肺癌細(xì)胞全抗原的DCs能誘導(dǎo)自體T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，且T細(xì)胞對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷率為(56.52±2.75)%；對正常細(xì)胞的殺傷率平均為(5.31±1.37)%，明顯低于對自體腫瘤細(xì)胞殺傷率(t=16.429，P<0.01)。對K562細(xì)胞殺傷率為(9.71±2.46)%，明顯低于對自體腫瘤細(xì)胞殺傷率(t=25.010，P<0.01)。結(jié)論 負(fù)載肺癌全抗原的DCs能誘導(dǎo)肺癌患者自體T細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒作用，且體外可有力的殺傷腫瘤細(xì)胞，而幾乎不殺傷正常細(xì)胞。

肺癌；全抗原；樹突狀細(xì)胞；自體T細(xì)胞；細(xì)胞毒作用

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.021

肺癌是人類最常見的癌癥，近年來其發(fā)病率和病死率增長迅速，也是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的癌癥之一。肺癌的治療經(jīng)過臨床工作者的不懈努力已得到迅速發(fā)展。免疫療法是腫瘤治療的新領(lǐng)域，其主要通過調(diào)節(jié)抗腫瘤的免疫反應(yīng)來達(dá)到治療腫瘤的目的。有報(bào)道稱樹突狀細(xì)胞的免疫治療在肺癌的臨床應(yīng)用中具有一定的有效性[1，2]，但尚缺乏有力的理論支持，且未見關(guān)于負(fù)載腫瘤抗原的DCs(表面表達(dá)腫瘤抗原肽的樹突狀細(xì)胞)對自體正常組織細(xì)胞的殺傷作用研究，故在本實(shí)驗(yàn)中對此進(jìn)行了研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑： RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；人重組GM-CSF、IL-4、TNF-α和IL-2購自R&D公司；AB血清由中心血站提供；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?。PE標(biāo)記的小鼠抗人CD80、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD83、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD1a、PerCP標(biāo)記的小鼠抗人HLA-DR、APC標(biāo)記的小鼠抗人CD11c均購自B&D公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本： 腫瘤組織、正常組織和外周血均取自手術(shù)治療的7例肺鱗狀細(xì)胞癌患者。男4例，女3例，年齡48～65(59±6)歲。TNM分期均為III期，手術(shù)前未接受任何治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞懸液制備： 按照文獻(xiàn)[3]方法稍加改良在室溫且無菌的條件下進(jìn)行。將手術(shù)中新鮮無菌采集的腫瘤組織和正常組織標(biāo)本放在無菌細(xì)胞培養(yǎng)液中，迅速送往實(shí)驗(yàn)室。用眼科剪去除結(jié)締組織、脂肪和壞死組織后，將組織標(biāo)本剪為1～3 mm3的小塊，用組織培養(yǎng)液洗滌2次。切碎的組織放在盛有酶溶液5 ml的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1 h，然后用連續(xù)密度離心法獲得單個(gè)細(xì)胞懸液。最后的細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)，然后凍存在液氮中。使用時(shí)，將細(xì)胞解凍并通過percoll梯度離心富集活細(xì)胞。NK細(xì)胞敏感的K562(人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株，在免疫實(shí)驗(yàn)中常用做靶細(xì)胞)用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為T細(xì)胞細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中的靶細(xì)胞。

1.2.2 肺癌細(xì)胞裂解液制備： 取2×107個(gè)腫瘤細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌，在液氮中冷凍10 min ，37℃水浴解凍，反復(fù)4次獲得天然的裂解液。離心去除大分子成分(先2 000 g離心10 min，然后4℃13 000 g離心60 min)，過濾滅菌，蛋白成分用Cummassie藍(lán)蛋白分析，然后等量分裝后于-80℃保存。

1.2.3 負(fù)載肺癌全抗原DC制備： 用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，并用含10%AB血清的完全培養(yǎng)液懸浮，于培養(yǎng)瓶中37℃、5%CO2、飽和濕度貼壁培養(yǎng)2 h。吸取未貼壁細(xì)胞用尼龍毛柱法分離T淋巴細(xì)胞，備用。在培養(yǎng)瓶中加入含GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基，GM-CSF和IL-4的終濃度分別為1 000 U/ml和800 U/ml，隔天吸去2 ml培養(yǎng)基，加入3 ml新鮮的含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。第4天，在未成熟DC中加入腫瘤細(xì)胞裂解物，蛋白終濃度為50 μg/ml，孵育過夜。第5天，按體積比加入25%的TNF-α。第7天收集腫瘤抗原致敏的成熟DCs。

1.2.4 負(fù)載肺癌全抗原DC的表型測定： 收集1.2.3中第5、7天的部分細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入流式管，200 μl/管，加入熒光素標(biāo)記的抗體，4℃孵育45 min，PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 T細(xì)胞增殖測定： 用30Gy γ射線照射負(fù)載肺癌全抗原的自體DCs，并將其作為刺激細(xì)胞，尼龍毛柱法富集的自體T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組(刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例分別為：1∶5、1∶10、1∶20)、PHA組(用2.5%PHA刺激的T細(xì)胞)、對照組(單純T細(xì)胞)，在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，加入含10%AB血清的完全培養(yǎng)基，終體積為200 μl，培養(yǎng)5 d，在結(jié)束培養(yǎng)前4 h，加入MTS，每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束，于490 nm檢測吸光度，并按下式計(jì)算刺激指數(shù)：刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組OD/對照組OD

1.2.6 腫瘤特異性CTLs誘導(dǎo)： 用30Gy γ射線照射的負(fù)載肺癌全抗原的DCs，調(diào)整濃度為1×105/ml，與2.5×106/ml尼龍毛柱分離的自體T細(xì)胞，按1∶10的比例加入到24孔培養(yǎng)板中，用含10%AB血清的RPMI1640，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)19 d。每周以1∶20的比率用負(fù)載腫瘤細(xì)胞抗原的DCs刺激反應(yīng)T細(xì)胞2次。每隔2 d加入新鮮的培養(yǎng)基和20 U/ml的人重組IL-2，后者在第2個(gè)刺激周期之后加入。第19天收集腫瘤抗原預(yù)先致敏的T細(xì)胞。

1.2.7 CTLs細(xì)胞毒作用測定： 解凍1.2.1中制備的單個(gè)肺癌腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞并用percoll梯度離心法富集活細(xì)胞，活細(xì)胞達(dá)到80%～90%。用不含AB血清的培養(yǎng)基洗滌肺癌細(xì)胞、正常乳腺細(xì)胞和K562細(xì)胞2次，用緩沖液再次懸浮細(xì)胞，加入1 mmol/L的新鮮配制的PKH-26染液，在37℃條件下孵育60 min，每15 min搖晃1次。在室溫加入500 μl人AB血清孵育30 s停止標(biāo)記反應(yīng)，并用含10%人AB血清的PRMI1640洗滌2次。將PKH-26標(biāo)記的靶細(xì)胞分別按1.2.6中誘導(dǎo)的抗原預(yù)先致敏T細(xì)胞以20∶1的比例加入到96孔培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)3 h，終體積為200 μl。收集細(xì)胞，用PBS洗滌，用緩沖液懸浮，并立即在黑暗的環(huán)境中加入FITC標(biāo)記Annexin V和PI在室溫孵育20 min，進(jìn)行流式檢測。并將相同量未標(biāo)記和PKH-26單獨(dú)標(biāo)記的靶細(xì)胞分別作為對照組和最大標(biāo)記組。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行三色流式細(xì)胞分析。用下列公式計(jì)算CTL的殺傷率：CTL殺傷率(%)=[實(shí)驗(yàn)組(%)-對照組(%)]/[最大標(biāo)記組(%)-對照組(%)]

2 結(jié) 果

2.1 負(fù)載肺癌全抗原DC形態(tài)及表型 通過在貼壁的單核細(xì)胞中加入GM-CSF和IL-4，培養(yǎng)3d后，出現(xiàn)了懸浮細(xì)胞，此后，懸浮細(xì)胞體積增大，數(shù)量增加。第5天，在負(fù)載肺癌全抗原的DCs中加入成熟誘導(dǎo)因子TNF-α，第7天，表現(xiàn)為松散聚集的細(xì)胞團(tuán)或具有典型樹突狀形態(tài)的單個(gè)懸浮細(xì)胞，用倒置顯微鏡觀察，這些細(xì)胞表現(xiàn)出樹突狀細(xì)胞的典型形態(tài)，細(xì)胞膜表面有許多不規(guī)則突起。用臺(tái)盼藍(lán)鑒定DCs活力達(dá)到98%以上。見圖1。

流式細(xì)胞術(shù)顯示與未成熟樹突狀細(xì)胞相比，CD14表達(dá)減少(t=20.157，P<0.01)，代表為成熟DCs的表面標(biāo)志CD1a、CD11c、CD80、CD83、HLA-DR表達(dá)增多(t=8.927，3.042,14.311,18.537,5.612，P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖1 培養(yǎng)7天的DCs形態(tài)(×400)

注：與未成熟DCs比較,aP<0.05，bP<0.01

2.2 負(fù)載肺癌全抗原的DCs對自體T細(xì)胞增殖能力的影響 自體T細(xì)胞經(jīng)γ射線照射的負(fù)載肺癌全抗原的DCs刺激后，7例患者的T細(xì)胞在3種比例培養(yǎng)基中，均能發(fā)生增殖反應(yīng)。刺激指數(shù)為6.98～39.15(21.56±4.38)。而且不同的DC∶T比率時(shí)的刺激指數(shù)有顯著性差異，DC∶T比率越高，刺激指數(shù)越高，T細(xì)胞增殖反應(yīng)能力越強(qiáng)(t=31.203，19.550，P<0.01)。見圖3。

2.3 腫瘤特異性T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 自體T細(xì)胞經(jīng)γ射線照射后的負(fù)載肺癌全抗原的DCs多次刺激后，誘導(dǎo)為抗原預(yù)先致敏的T細(xì)胞，將其與經(jīng)PHK-26染色的肺癌細(xì)胞、正常肺組織細(xì)胞和K562細(xì)胞共培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞毒性分析。T細(xì)胞對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷率為(23.16±1.13)%～(80.44±5.35)%，平均為(56.52±2.75)%；對正常細(xì)胞的殺傷率為(1.2±0.32)%～(13.12±3.48)%，平均為(5.31±1.37)%；對K562細(xì)胞殺傷率平均為(9.71±2.46)%，明顯低于對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷率(t=25.010，P<0.01)。明顯低于對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷率(t=16.429，P<0.01)。見圖4。

3 討 論

樹突狀細(xì)胞是機(jī)體最有效的、能激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞來源于骨髓，定居于非淋巴組織，處于靜止或者未成熟狀態(tài)，他們能有效地捕獲和加工處理抗原，當(dāng)受到抗原刺激后，樹突狀細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷成熟過程，表達(dá)MHC分子和共刺激分子并遷移至外周淋巴器官，此時(shí)抗原提呈能力增強(qiáng)，激活初始T細(xì)胞[4]。由于它們激活靜息T細(xì)胞的獨(dú)一無二的能力，因此樹突狀細(xì)胞在免疫治療中，特別是對惡性腫瘤的抗腫瘤免疫治療中，具有優(yōu)先權(quán)。

注：A.每位患者平均刺激指數(shù)；B.不同DC∶T比率的平均刺激指數(shù)；與1∶20組比較，aP<0.01；與1∶10組比較，bP<0.01

圖3 負(fù)載肺癌全抗原的DCs對自體T細(xì)胞增殖能力的影響

注：與腫瘤細(xì)胞組比較,aP<0.01

由于用全部肺癌細(xì)胞裂解液去致敏DCs時(shí)，不僅腫瘤抗原可被DCs提呈，而且其中包含的自身抗原也可被提呈，因此，自身抗原的提呈是否會(huì)誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)是不容忽視的問題。故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察了負(fù)載自體腫瘤全抗原的樹突狀細(xì)胞對自體正常細(xì)胞的殺傷作用，這是其他學(xué)者所沒有研究的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)被激活的T細(xì)胞對自身正常組織也有一定的殺傷作用，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對自體肺癌細(xì)胞的殺傷作用。

總之，我們發(fā)現(xiàn)負(fù)載肺癌全抗原的DCs能誘導(dǎo)肺癌患者T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在體外有力地殺傷腫瘤細(xì)胞，而幾乎不殺傷正常細(xì)胞。本結(jié)果為臨床上進(jìn)行腫瘤DC-CIK的免疫治療提供了有力的支持。

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In vitro study of T cell responses induced by lung cancer’s whole antigen pulsed with autologous dendritic cells

HUOZhongchao*,LIUXiaoxia,WANGXueling,CHENJianhua,SUYing.

*DepartmentofOncology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan056002,ChinaCorrespondingauthor:WANGXueling,E-mail:wangxuelingcool@126.com

Objective To investigate the load cell lung cancer antigen autologous dendritic (DCs)-induced T cell proliferation and cytotoxicity in vitro.Methods Lung cancer tissue, normal lung tissue and peripheral blood of fresh specimens were taken from 7 patients with squamous cell carcinoma who were treated with operation, normal lung tissue and lung cancer were prepared for single cell suspension. From the peripheral blood, mononuclear cells isolated and induced DCs; nylon wool columns were used to isolate the T cells. Using frozen melt method to prepare the autologous lung cancer cell lysates liquid, and stimulate the DCs, preparation of loaded with autologous lung cancer antigen DCs. Using MTS method to detect DCs complete antigen load of lung cancer on T cell proliferation; flow cytometry determination of DCs phenotype and the effect of load DCs complete antigen of lung cancer on T cell cytotoxicity.Results Peripheral blood mononuclear cells through GM-CSF, IL-4 and TNF-α’s induce, a large number of dendritic protrusions, surface molecules CD14 expression was significantly lower (t=20.157,P<0.01),CD1a,CD11c,CD80,CD83andHLA-DRexpressionwassignificantlyincreased(t=8.927,t=3.042,t=14.311,t=18.537，t=5.612,P<0.05,P<0.01),matureDCswhichwasobtainfromwholeloadoflungcancerantigencanstimulateautologousTcellproliferation,differentpatientsrevealeddifferentstimulationindex: 6.98-39.15 (21.56±4.38),andthehighertheDC/Tratio,thehigherthestimulationindex,thestrongerofTcellsabilitytorespondtotheproliferation(t=31.203,t=19.550,P<0.01);DCsofloadlungcancercellwholeantigencaninducecytotoxicityofautologousTcells,andTcellstoautologoustumorcellkillingratewas(56.52 ± 2.75)%;normalcellaveragekillingratewas(5.31 ± 1.37)%,significantlylowerthanfortheautologoustumorcellkillingrate(t=16.429,P<0.01).ThekillingrateofK562cellwas(9.71±2.46)%,whichissignificantlylowerthanthekillingrateofautologoustumorcells(t=25.010,P<0.01). Conclusion Load lung cancer complete antigen’s DCs can induce lung cancer patients’ autologous T cell proliferation and cytotoxicity, and can effectively kill tumor cells in vitro, and normal cells were not killed.

Lung cancer; Whole antigen; Dendritic cells; Autologous T cells; Cytotoxicity

邯鄲市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.1123108079-5)

056002 邯鄲，河北工程大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤科(霍忠超、蘇英)，河北工程大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院免疫教研室(劉曉霞、 王雪玲、陳劍華)

王雪玲，E-mail:wangxuelingcool@126.com

2014-09-05)