孟麗霞，王均鵬，曾凡軍，阮玉姝，趙必君，熊曉琪

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培哚普利對COPD大鼠肺功能及IL-8、TNF-α含量的影響

孟麗霞，王均鵬，曾凡軍，阮玉姝，趙必君，熊曉琪

目的 觀察培哚普利對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺功能和肺組織及血清中炎性因子的影響。方法 將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，A組(正常對照組)、B組(LPS組)、C組(ACEI+LPS組)，每組10只。采用2次氣管滴注脂多糖(LPS)加煙熏的方法建立COPD大鼠模型，通過檢測大鼠肺功能和血清及肺組織勻漿中IL-8、TNF-α含量，觀察培哚普利對大鼠肺功能和體內(nèi)炎性因子的影響。結(jié)果 (1) 大鼠呼吸功能測定：A組、B組與C組的VE值(ml/min)分別為180.50±23.58、108.50±33.53與140.90±33.10；PEP值(ml/s)分別為30.20±1.67、20.30±2.78與25.77±3.45；FEV0.3值(ml)分別為4.91±0.30、4.01±0.30與4.55±0.18；與A組相比，B組、C組VE值分別下降40%、22%,PEP值分別下降33%、15%,FEV0.3值分別下降18%、7%。3組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)大鼠血清中IL-8含量(ng/L)，A、B、C組分別為211.69±13.40、386.10±26.52、324.58±25.49；肺組織勻漿中A、B、C組分別為348.96±4.78、439.28±15.15、394.00±9.78，3組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠血清中TNF-α含量，A、B、C組分別為42.28±2.55、102.86±5.99、68.90±3.20；肺組織勻漿中A、B、C組分別為131.44±7.90、201.21±4.98、154.34±4.73，3組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 培哚普利能明顯改善COPD大鼠肺功能，其機(jī)制可能是通過下調(diào)COPD大鼠血清和肺組織勻漿中IL-8、TNF-α含量而實(shí)現(xiàn)。

慢性阻塞性肺疾?。话捉樗?8；腫瘤壞死因子-α；培哚普利；脂多糖；大鼠

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.019

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是中老年患者發(fā)病率頗高的呼吸系統(tǒng)疾病，在我國40歲以上人群的發(fā)病率約為8.2%[1]，其病死率占據(jù)我國目前農(nóng)村人口十大死因中第3位[2]，每年死亡人數(shù)達(dá)100萬[3]。盡管COPD發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，但普遍認(rèn)為慢性氣道炎性反應(yīng)是其中心環(huán)節(jié)。近期國內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在COPD誘導(dǎo)的肺損傷中，腎素—血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)被過度激活，其中的多效應(yīng)分子血管緊張素II (angiotensin II, Ang II)在COPD誘導(dǎo)的肺損傷時(shí)過度表達(dá)[4]，而且通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibition, ACEI)和/或血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blockers, ARB)下調(diào)其表達(dá)量及作用效應(yīng)對肺損傷可以產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用?，F(xiàn)以ACEI類藥物——培哚普利對COPD大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠肺功能、血清及肺組織勻漿中白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量的變化及培哚普利的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級雄性SD大鼠30只(由三峽大學(xué)動(dòng)物中心提供)，2～3月齡，體質(zhì)量(250±20)g，飼養(yǎng)條件如下：5只1籠，室溫20℃，濕度50%～60%，通風(fēng)良好，自由攝食攝水，常規(guī)普通飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組10只。A組(正常對照組)、B組(LPS組)、C組(ACEI+LPS組)。藥物與試劑：脂多糖(LPS)系美國Sigma公司產(chǎn)品；培哚普利(雅施達(dá))，8 mg/片，由施維雅(天津)制藥有限公司提供；ELISA檢測試劑盒系武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司產(chǎn)品；紅金龍牌香煙由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，焦油含量13 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量14 mg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 參照宋一平等[5]采用2次氣管內(nèi)滴注LPS聯(lián)合煙熏法制備COPD大鼠模型。具體操作如下：分別在第1天和第7天向A組大鼠氣管內(nèi)滴注生理鹽水1 ml，B組與C組滴入相同體積濃度為1 μg/g 的LPS溶液。在第2～13天、15～28天，每日上午將3組大鼠置于密閉箱內(nèi)，A組大鼠不做任何處理，30 min后用生理鹽水灌胃(2.5 ml)；B組與C組大鼠的密閉箱內(nèi)點(diǎn)燃紅金龍牌香煙，煙熏大鼠30 min，然后B組大鼠也用生理鹽水灌胃(2.5 ml)；C組大鼠用培哚普利溶液200 mg/L以2×10-3mg·g-1·d-1的劑量灌胃(2.5 ml)。第28天時(shí)采用小動(dòng)物呼吸功能測定儀檢測3組大鼠的肺功能，然后禁食大鼠12 h，用4%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉后固定、解剖大鼠，腹主動(dòng)脈取血5 ml置于預(yù)冷的負(fù)壓真空采血管中，靜置2 h后，1 000 r/min，4℃離心20 min，收集上清液即血清于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?；同時(shí)，取肺組織，用冰生理鹽水沖洗后置于凍存管中并立即存放于液氮中備用。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 呼吸功能： 利用小動(dòng)物呼吸功能測定儀(北京宣武醫(yī)院制)測定大鼠呼吸功能：每分鐘呼氣量(VE)、最大呼氣流量(PEF)和0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)。

1.3.2 IL-8、TNF-α測定： 解凍備用血清，每只大鼠取血清1 ml，用ELISA 法檢測各組大鼠血清中IL-8、TNF-α含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。稱取每只大鼠肺組織100 mg，加入冰生理鹽水1 ml，用組織勻漿器制成10%的肺組織勻漿，3 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，用ELISA 法檢測各組大鼠肺組織上清液中IL-8、TNF-α含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠癥狀體征觀察 建模結(jié)束后B組大鼠神情倦怠，拱背蜷縮，皮毛發(fā)黃，毫無光澤，脫毛嚴(yán)重，活動(dòng)能力下降，進(jìn)食及飲水量較A組明顯減少，出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、哮鳴、呼吸困難等癥狀，體型消瘦，靈敏度降低，大便干澀，小便色暗黃。C組大鼠上述癥狀及體征較B組減輕。

2.2 呼吸功能 待藥物干預(yù)28d結(jié)束后，與A組比較，B組、C組VE值分別下降40%、22%；PEP值分別下降33%、15%；FEV0.3值分別下降18%、7%；3組間兩兩比較有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。見表1。

2.3IL-8、TNF-α變化 血清及肺組織勻漿中IL-8、TNF-α含量B組大鼠最高，其次是C組，最低的是A組(P<0.05、P<0.01)，見表2。

表1 呼吸功能的測定結(jié)果

注：與A組比較，aP<0.05，bP<0.01；與B組比較，cP<0.05

表2 大鼠IL-8、TNF-α測定結(jié)果

注：與A組比較，aP<0.05，bP<0.01；與B組比較，cP<0.05

3 討 論

COPD是以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管慢性炎性反應(yīng)為主要特征，在吸煙和反復(fù)下呼吸道感染等致病因素的作用下導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性下降的一組疾病。本研究利用LPS2次氣管滴注加煙熏以建立COPD大鼠模型，結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的COPD大鼠模型組即3組的VE值較正常對照組即A組的VE值有顯著下降。表明LPS可直接引起大鼠氣道上皮的損傷導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性下降，其誘導(dǎo)的COPD大鼠模型是可靠的，造模成功。

COPD氣道炎性反應(yīng)的病理過程中，中性粒細(xì)胞(PMN)及其分泌的多種細(xì)胞因子參與機(jī)體的防御和修復(fù)效應(yīng)[6]，其中主要的有IL-8、TNF-α等[7]。IL-8是所有CXC亞家族中趨化活性最強(qiáng)的趨化因子，研究顯示[8]，在COPD患者感染的肺組織中，IL-8可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞變形、定向游走，并引發(fā)呼吸爆發(fā)及炎性介質(zhì)的釋放，并且其作用與患者的氣流阻塞程度密切相關(guān)，可作為COPD急性加重期的重要指標(biāo)之一，能在一定程度上反映疾病的嚴(yán)重程度并影響疾病的預(yù)后[9]。TNF-α是一種介導(dǎo)炎性反應(yīng)的多功能細(xì)胞因子，它不僅可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子, 誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞生成IL-8；而且能激活炎性細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)，釋放更多的氧和氮基團(tuán)以及其他細(xì)胞因子，促進(jìn)COPD的發(fā)生。研究證實(shí)[10，11]，COPD患者氣道炎性反應(yīng)程度與血清及肺泡灌洗液中TNF-α水平顯著相關(guān)。FoschinoBarbaro等[12]研究表明，在血清、呼出氣冷凝液及誘導(dǎo)痰中TNF-α濃度與COPD患者肺功能呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。本結(jié)果顯示，B組和C組大鼠血清和肺組織勻漿中IL-8、TNF-α含量較A組均有顯著升高，與上述研究結(jié)果相一致。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)在COPD誘導(dǎo)的肺損傷中，RAS被激活，其中AngⅡ通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB上調(diào)致炎性因子表達(dá)[11]、促進(jìn)組織纖維增生[14]、產(chǎn)生細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)等參與COPD的病理過程[15]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究[16～21]表明血管緊張素受體拮抗劑(angiotensinreceptorblockers,ARB)和血管緊張素酶抑制劑(angiotensinconvertingenzymeinhibition,ACEI)能通過下調(diào)AngII效應(yīng)減弱脂多糖、AngII注射、機(jī)械通氣等所導(dǎo)致的大鼠急性肺損傷。部分臨床觀察也表明，ACEI和ARB類藥物能改善重度COPD合并肺心病患者的肺功能[22，23]。本結(jié)果顯示，C組大鼠癥狀體征改變較B組有明顯減輕；肺功能測定VE值、PEP值、FEV0.3值下降程度均有明顯減輕；大鼠血清和肺組織勻漿中IL-8、TNF-α含量則明顯減少。表明使用ACEI抑制劑培哚普利干預(yù)后，能明顯減少COPD大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)因子IL-8、TNF-α的產(chǎn)生，并顯著改善COPD大鼠肺功能。由于目前ACEI類藥物在COPD臨床領(lǐng)域的研究相對較少，對COPD患者的遠(yuǎn)期療效，還需要大規(guī)模、多中心、隨機(jī)、雙盲的臨床試驗(yàn)予以進(jìn)一步證實(shí)。但ACEI類藥物對COPD氣道炎性反應(yīng)過程中RAS系統(tǒng)的抑制效應(yīng)及其對COPD肺功能的改善作用，有望成為我們治療COPD疾病的新選擇。

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Effect of perindopril on lung function and IL-8,TNF-α in COPD rat model

MENGLixia*,WANGJunpeng,ZENGfanjun,RUANYushu,ZHAOBijun,XIONGXiaoqi.

*DepartmentofRespiratoryMedicine,FirstClinicalMedicalCollege，ThreeGorgeUniversityYichangCentralHospital,Yichang443000,ChinaCorrespondingauthor:ZENGfanjun,E-mail:dearmlx@126.com

Objective To observe the effect of perindopril on pulmonary function and lung tissue inflammatory factor in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) rats.Methods 30 male SD rats were randomly divided into 3 groups: group A (normal control group), group B (LPS group), group C (ACEI+LPS group), 10 rats in each group. Using the 2 times tracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS) method and smoking to establish the rat model of COPD, detect rat pulmonary function and serum and lung homogenate's IL-8, TNF-α content, then to observe the effect of perindopril on rat pulmonary function and inflammatory factor. Results (1) Respiratory function in rats: group A, group B and C group's VE values (ml/min), were 180.50±23.58, 108.50±33.53 and 140.90±33.10; PEP value (ml/s) were 30.20±1.67, 20.30±2.78 and 25.77±3.45; the value of FEV0.3(ml) were 4.91±0.30, 4.01±0.30 and 4.55±0.18 ; compared with A group, group B and C's VE values were decreased by 40%, 22%, PEP value decreased by 33%, 15% respectively, the FEV0.3decreased by 18%, 7% respectively. Compared among the 3 groups, the difference was statistically significant (P<0.05). (2) Serum IL-8 content (ng/L) in rat, groups A, B, C were 211.69±13.40, 386.10±26.52, 324.58±25.49; lung homogenate ingroup A, B, C were 348.96±4.78, 439.28± 15.15, 394.00± 9.78, compared among the 3 groups, the differences were statistically significant (P<0.05).TheserumcontentofTNF-αinrat,groupA,B,Cwere42.28±2.55and102.86±5.99, 68.90±3.20;lungtissuehomogenateingroupA,B,Cwere131.44±7.90,201.21±4.98, 154.34±4.73,comparedamongthe3groups,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Conclusion It demonstrated that the perindopril could significantly improve lung function of COPD rats and its mechanism may be realized through the down-regulation serum IL-8, TNF-α content and lung tissue homogenate in COPD rats.

Chronic obstructive pulmonary disease; Interleukin-8; Tumor necrosis factor alpha ; Perindopril; Lipopolysaccharide; Rats

443000 三峽大學(xué)第一臨床學(xué)院/宜昌市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科(孟麗霞、曾凡軍、阮玉姝、趙必君、熊曉琪)； 三峽大學(xué) 人民醫(yī)院心內(nèi)科(王均鵬)

曾凡軍，E-mail:dearmlx@126.com

2014-10-01)