李 柰，樊 琛，李小波，龍立梅，曹學(xué)麗

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

食用植物油中生育酚含量測(cè)定方法優(yōu)化及分析

李 柰，樊 琛，李小波，龍立梅，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

采用高效液相色譜法測(cè)定了8種24個(gè)植物油樣本中生育酚的含量，并對(duì)生育酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。在室溫下，以甲醇為溶劑，采用超聲法進(jìn)行提取，料液比為1∶1.25，提取3次，每次20 min，采用液相色譜方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明：該方法在生育酚質(zhì)量濃度為0.05～1.00 g/L時(shí)，相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)到0.999 2～0.999 4，線性關(guān)系良好；檢出限分別為α-生育酚0.5 mg/L，γ-生育酚2.0 mg/L，δ-生育酚1.2 mg/L；三水平加標(biāo)樣品的平均回收率為92.1%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為2.5%～8.5%。在8種植物油中，葵花籽油中α-生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可達(dá)4.2349×10-4，大豆油的β/γ-生育酚、δ-生育酚及總生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為7.371 3×10-4，1.621 5×10-4，9.883 6×10-4。

食用植物油；生育酚；高效液相色譜法

生育酚（tocopherol）即維生素E，是一種脂溶性維生素，外觀呈無(wú)色至淺黃色，幾乎無(wú)嗅，氧化后顏色逐漸變深至棕紅色［1］。天然生育酚包含4種右旋光學(xué)異構(gòu)體［2］，根據(jù)其苯環(huán)上所含甲基位置和數(shù)目的不同，將它們分別命名為α，β，γ和δ-生育酚。每種生育酚異構(gòu)體的生物活性強(qiáng)弱不同，其中以α-生育酚的生物活性最高［3］，δ-生育酚的抗氧化能力最強(qiáng)［4］。生育酚具有抗不育［5-6］、抗衰老［7-8］、抗氧化［9-11］、免疫調(diào)節(jié)［12-14］、胰島細(xì)胞保護(hù)［15-16］等諸多功能，因而被人們廣泛研究。植物油是人們?nèi)粘Ｉ钪蝎@取生育酚的主要來(lái)源之一，不同品種的植物油中生育酚的含量有較大差異［17］，因此生育酚的組成和含量可以作為食用植物油脂品質(zhì)的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)［18］。

目前，生育酚的分析方法包括高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、紙層析法、柱層析法、比色法等［19-22］，最常用的是高效液相色譜法，我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［23-24］、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［25］均采用此法。這些標(biāo)準(zhǔn)在液相色譜分析前均采用了皂化方法進(jìn)行提取，該方法時(shí)間長(zhǎng)而且步驟復(fù)雜。為尋找更加簡(jiǎn)單易行的提取方法，本實(shí)驗(yàn)擬采用超聲法對(duì)生育酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用高效液相色譜法測(cè)定北京居民經(jīng)常食用的8個(gè)種類(lèi)24個(gè)植物油樣本中生育酚的含量，為居民選用富含生育酚的植物油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物油樣品分別從北京各大超市購(gòu)買(mǎi)，共8個(gè)種類(lèi)24個(gè)品牌，包括橄欖油（壓榨，一級(jí)）、玉米油（壓榨，一級(jí)）、花生油（壓榨，一級(jí)）、葵花籽油（壓榨，一級(jí)）、調(diào)和油、大豆油（浸出，一級(jí)）、芝麻油（壓榨，一級(jí)）、亞麻籽油（壓榨，一級(jí)），每個(gè)種類(lèi)選取1～5個(gè)不同品牌；生育酚標(biāo)準(zhǔn)品：α-生育酚（色譜級(jí)，純度99.8%）、β-生育酚（色譜級(jí)，純度99.5%）、γ-生育酚（色譜級(jí)，純度99.0%）、δ-生育酚（色譜級(jí)，純度98.3%），Sigma公司；無(wú)水甲醇（分析純），北京化工廠；甲醇（色譜純），F(xiàn)isher Scientific；純水由Millipore-Q純水機(jī)自制。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；GR-200型電子分析天平，北京儀誠(chéng)科技公司；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；1260型高效液相色譜系統(tǒng)（配自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器DAD和色譜工作站等），美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件的選擇

安捷倫ZORBAX SB-C18型色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，流動(dòng)相甲醇與水的體積比為98∶2，等度洗脫15 min，流速1.0 mL/min，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)295 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱(chēng)取α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別用甲醇溶解定容到10.0 mL棕色容量瓶中，各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為1.00 g/L，并放置冰箱保存。使用前調(diào)至不同質(zhì)量濃度，并用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確質(zhì)量濃度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的標(biāo)定

分別取生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液100.0 μL，用無(wú)水甲醇分別稀釋定量至10.0 mL容量瓶中，在295 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各生育酚的吸光值，用比吸光系數(shù)計(jì)算各生育酚的質(zhì)量濃度。

計(jì)算公式見(jiàn)式（1）。

式（1）中，C1為生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，g/L；A為生育酚的平均紫外吸光值；E為生育酚1%比吸光系數(shù)（α、γ、δ-生育酚的E值分別以73，92，93帶入）；V2為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定溶液體積（10.0 mL）；V1為標(biāo)準(zhǔn)溶液取用量，mL。

1.3.4 提取條件的選擇

以某品牌大豆油為原料，在室溫情況下，采用超聲波法進(jìn)行提取，將甲醇作為提取溶劑，分別考慮提取次數(shù)、料液比以及提取時(shí)間3個(gè)條件對(duì)提取效果的影響。

1）提取次數(shù)的確定。取1.0 g大豆油，加入10.0 mL甲醇，超聲提取20 min后將上清液倒出并再次加入等體積甲醇，超聲相同時(shí)間，以此類(lèi)推，共提取5次。

2）料液比的確定。將大豆油與甲醇按不同提取比例1∶10，1∶5，1∶1.67，1∶1.25，1∶1，1∶0.5（g/mL）進(jìn)行提取，（樣品質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.6，0.8，1.0，2.0 g/mL），共提取5次，每次超聲20 min。

3）提取時(shí)間的確定。取1.0 g大豆油，加入10.0 mL甲醇，超聲提取時(shí)間分別為10，20，30，40，50 min，共提取5次，每次均將上清液倒出并加入等體積甲醇進(jìn)行再次提取。

將每次提取出的上清液濃縮至干，加1.0 mL甲醇溶解過(guò)膜，用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 加標(biāo)回收率與精密度

為了考察整個(gè)方法的可靠性，分別對(duì)植物油中大豆油、調(diào)和油、玉米油的1號(hào)品牌進(jìn)行混合生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別加入50，100，150 μL質(zhì)量濃度為0.10 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，每個(gè)水平重復(fù)3次，然后按照1.3.1的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 不同種類(lèi)植物油中生育酚含量測(cè)定

選用市售8個(gè)不同種類(lèi)、不同品牌的植物油作為樣品，按照優(yōu)化的方法進(jìn)行超聲提取，并進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 生育酚標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of tocopherol standards

2.1 工作曲線與檢出限分析

生育酚異構(gòu)體共4種物質(zhì)，但用普通C18反相色譜柱分析時(shí)，β-生育酚與γ-生育酚會(huì)在同一時(shí)間出峰，無(wú)法分開(kāi)。α-生育酚、β/γ-生育酚、δ-生育酚的液相色譜如圖1。在選定的色譜條件下，測(cè)定α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)信噪比（S/N=3）計(jì)算各組分的檢出限，結(jié)果如表1。生育酚異構(gòu)體在質(zhì)量濃度為0.05～1.00 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.1 Appearance time，standard curves，correlation coefficients（R2）and limits of detection of tocopherols

2.2 提取條件優(yōu)化

大豆油提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。由圖2可知，料液比對(duì)提取結(jié)果的影響最大，開(kāi)始時(shí)隨著大豆油加入量的增多，提取到的生育酚含量也越來(lái)越多，但是當(dāng)提取比例大于1∶1.25（g/mL）時(shí)，提取到的生育酚的含量有所降低，這主要是由于植物油加入量過(guò)多時(shí)，甲醇不能將其完全提取，脂溶性的生育酚在植物油中有殘留［26］，所以最適的提取比例為1∶1.25（g/mL，即質(zhì)量濃度為0.8 g/mL）。在提取次數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，提取3次基本上可以將生育酚提取完全，所以最適的提取次數(shù)為3次。提取時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響最小，而且隨著超聲時(shí)間的增加，生育酚含量有輕微降低，這可能是超聲過(guò)程中溫度升高，生育酚緩慢分解導(dǎo)致，考慮生育酚提取完全以及經(jīng)濟(jì)性原則，選擇較佳的提取時(shí)間為20 min。

圖2 大豆油提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Single factor experiments of soybean oil extraction

2.3 方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性分析

植物油中大豆油、調(diào)和油、玉米油1號(hào)品牌的混合生育酚標(biāo)準(zhǔn)品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，加標(biāo)樣品的平均回收率為92.1%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為2.5%～8.5%，說(shuō)明此方法對(duì)生育酚的測(cè)定具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 生育酚的加標(biāo)回收率及RSD值Tab.2 Spiked recovery and RSD of tocopherols%

2.4 植物油中生育酚檢測(cè)結(jié)果

選取8種植物油共24個(gè)樣品按照優(yōu)化條件進(jìn)行超聲提取，然后運(yùn)用HPLC方法進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果如圖3。通過(guò)圖3可明顯看出，在8種植物油中大豆油中β/γ-生育酚及δ-生育酚的含量最高，葵花籽油中α-生育酚的含量最高。

圖3 不同植物油液相分析色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of different edible vegetable oils

生育酚含量的具體計(jì)算結(jié)果如圖4。由圖4可知，活性最強(qiáng)的α-生育酚在葵花籽油（12～14號(hào)）中的含量較高，12號(hào)葵花籽油樣品中α-生育酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到4.234 9×10-4。β/γ-生育酚和δ-生育酚在玉米油（4～6號(hào)）、調(diào)和油（15～17號(hào)）、大豆油（18～20號(hào)）、芝麻油（21～23號(hào)）中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其中大豆油的含量最為豐富，在19號(hào)大豆油樣品中β/γ-生育酚、δ-生育酚及總生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可分別高達(dá)7.371 3×10-4，1.621 5×10-4，9.883 6 ×10-4。從總生育酚含量上分析，8種植物油生育酚含量由高到低順序基本為：大豆油、調(diào)和油、玉米油、葵花籽油、芝麻油、亞麻籽油、花生油、橄欖油。

3 結(jié)論

圖4 不同植物油樣品生育酚含量分析Fig.4 Column chart analysis of tocopherols content in different edible vegetable oils

本實(shí)驗(yàn)采用超聲法優(yōu)化了植物油中生育酚異構(gòu)體的提取條件，并采用高效液相色譜法測(cè)定了8種植物油中24個(gè)樣品的含量。最適宜的超聲提取方法為：在室溫條件下，以甲醇為提取溶劑，料液比例為1∶1.25，超聲提取3次，每次20 min。該方法在生育酚質(zhì)量濃度為0.05～1.00 g/L時(shí)，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.999 2～0.999 4，線性關(guān)系良好；液相測(cè)定生育酚的檢出限分別為：α-生育酚0.5 mg/L，γ-生育酚2.0 mg/L，δ-生育酚1.2 mg/L；三水平加標(biāo)樣品的平均回收率為92.1%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為2.5%～8.5%，說(shuō)明此方法對(duì)生育酚的測(cè)定具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。8種類(lèi)型的植物油中，大豆油所含的β/γ-生育酚和δ-生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都很高，最高值可分別達(dá)到7.371 3×10-4和1.621 5×10-4，總生育酚為9.883 6×10-4。活性最強(qiáng)的α-生育酚在葵花籽油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可達(dá)到4.234 9×10-4，從總生育酚含量上分析，8種植物油生育酚含量由高到低順序?yàn)椋捍蠖褂?、調(diào)和油、玉米油、葵花籽油、芝麻油、亞麻籽油、花生油、橄欖油。本實(shí)驗(yàn)與國(guó)標(biāo)中采用的皂化提取方法相比，操作更加簡(jiǎn)單易行，且大大縮短了前處理時(shí)間，可為植物油中生育酚的提取及檢測(cè)提供參考。

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Optimization of Determination Method and Analysis on Tocopherol Content in Edible Vegetable Oils

LI Nai，F(xiàn)AN Chen，LI Xiaobo，LONG Limei，CAO Xueli*
（School of Food and Chemical Engineering/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

The tocopherol contents in 8 kinds of edible vegetable oils（total 24 samples）were determined by HPLC and the extraction conditions were optimized.Tocopherol was extracted three times by the ultrasonic method and the extraction conditions were liquid material ratio 1∶1.25 and extraction time 20 min. The results showed that the correlation coefficient R2was 0.999 2-0.999 4 within the scope of 0.05-1.00 g/L.The detection limits of α-tocopherol，γ-tocopherol，and δ-tocopherol were 0.5，2.0，1.2 mg/L，respectively，and the recovery average was 92.1%-99.8%.Meanwhile，the relative standard deviation（RSD，n=3）was between 2.5%-8.5%.Sunflower seed oil had the highest α-tocopherol content（4.234 9×10-4）while soybean oil had the highest β/γ-tocopherol（7.371 3×10-4），δ-tocopherol（1.621 5×10-4），and total tocopherols（9.883 6×10-4）contents.

edible vegetable oils；tocopherols；HPLC

葉紅波）

TS227

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.03.011

2095-6002（2015）03-0059-05

李柰，樊琛，李小波，等.食用植物油中生育酚含量測(cè)定方法優(yōu)化及分析［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（3）：59-63.

LI Nai，F(xiàn)AN Chen，LI Xiaobo，et al.Optimization of determination method and analysis on tocopherol content in edible vegetable oils［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（3）：59-63.

2014-07-09

北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（KZ201410011016）。

李 柰，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程；

*曹學(xué)麗，女，教授，博士，主要從事生物分離技術(shù)方面的研究。

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