姚興存，邱春江，賴小燕

（淮海工學院海洋學院，江蘇連云港 222005）

紫菜風味香精的制備及其風味成分分析

姚興存，邱春江，賴小燕

（淮海工學院海洋學院，江蘇連云港 222005）

以條斑紫菜為原料，研究紫菜的酶解及其風味香精制備技術(shù)。通過比較不同蛋白酶對條斑紫菜的水解能力及對水解后風味的影響，進而篩選水解用蛋白酶。利用篩選的風味蛋白酶酶解紫菜，以水解度和感官評價為評價指標，通過正交試驗確定風味蛋白酶水解紫菜的較佳工藝條件為：溫度55℃，時間3 h，加酶量3%。以此酶解液進行美拉德反應(yīng)制備紫菜風味香精，通過響應(yīng)面分析法確定美拉德反應(yīng)的工藝配方與工藝條件為：谷氨酸1 mg/mL，甘氨酸0.5 mg/mL，半胱氨酸0.15 mg/mL，木糖8 mg/mL，葡萄糖4 mg/mL，硫胺素0.4 mg/mL，溫度110℃，pH6，時間50 min，制備的紫菜風味香精香味濃郁、鮮味明顯，腥味減弱。氨基酸分析結(jié)果表明，酶水解后谷氨酸和丙氨酸含量增加明顯，參與美拉德反應(yīng)的氨基酸主要有甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等。采用GC-MS測定產(chǎn)物中的揮發(fā)性風味成分，共檢測出41種風味物質(zhì)。

條斑紫菜；酶解；美拉德反應(yīng)；風味香精

條斑紫菜（Porphyra yezoensis Ueda）是東亞地區(qū)人工養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟海藻，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、無機鹽及維生素等，蛋白質(zhì)含量一般為紫菜干基的24%～40%［1］。近幾年，隨著紫菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，紫菜加工也逐步向精深加工方面發(fā)展［2-3］。

美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）是非酶促褐變反應(yīng)之一，在食品工業(yè)中具有重要意義。通過不同糖類和氨基酸進行美拉德反應(yīng)，能獲得各種不同的風味［4-6］。在天然調(diào)味料中，利用美拉德反應(yīng)制備的水產(chǎn)調(diào)味料含有多種呈味成分并具有保健功能，尤其受到人們的青睞［7-10］。利用美拉德反應(yīng)制備香精產(chǎn)生風味物質(zhì)的反應(yīng)歷程、產(chǎn)物性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，受到氨基酸、糖、含硫化合物等組分種類、性質(zhì)的影響，同時還與反應(yīng)的pH、溫度和時間等條件密切相關(guān)。

本研究以低值條斑紫菜為原料，采用酶解技術(shù)獲得并增加具有呈味特性的氨基酸、短肽的種類與含量，優(yōu)化蛋白酶的水解條件，輔以肉香味前體物質(zhì)，確定美拉德反應(yīng)工藝條件，通過美拉德熱反應(yīng)制備紫菜風味香精，采用GC-MS分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）揮發(fā)性風味成分的構(gòu)成，為生產(chǎn)制備高質(zhì)量的風味香精提供科學依據(jù)。不僅提高了紫菜的利用價值，具有市場開發(fā)價值，而且為開發(fā)新型海鮮風味食品提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜為本地企業(yè)生產(chǎn)的低值紫菜干品，購于超市。中性蛋白酶購于諾維信公司；木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等為廣州市齊云生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、木糖、葡萄糖等均為國產(chǎn)分析純化學試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

AF-06A型粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；JMS-50型酸度計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Primo R型多用途臺式高速冷凍離心機，美國熱電公司；KS-300型超聲波細胞粉碎機，寧波科生儀器廠；1100型高效液相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；6890N/5973i型氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國Agilent科技有限公司；SP-1500型實驗型噴霧干燥機，上海順儀實驗設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫菜風味香精制備技術(shù)流程

將紫菜于50℃干燥至恒重，高速粉碎機粉碎后過100目篩。按照ρ（紫菜）=0.05 g/mL的比例加水在20～25℃浸泡10 h，分別加入一定質(zhì)量分數(shù)（以紫菜蛋白質(zhì)量計，即酶底比，E/S）的蛋白酶，調(diào)整各蛋白酶的適宜水解條件并水解3 h，水解過程中經(jīng)常攪拌，水解結(jié)束后立即升溫至100℃，滅酶處理10 min，冷卻后為紫菜酶解液。向酶解液中加入一定量的還原糖和氨基酸，控制適當溫度進行美拉德反應(yīng)一定時間，立即冷卻到室溫，得到紫菜MRPs溶液，適當濃縮后噴霧干燥，得到紫菜風味香精產(chǎn)品。

1.3.2 水解度測定

水解液中總氨態(tài)氮含量根據(jù)中性甲醛電位滴定法測定［11］，樣品總氮含量按凱氏定氮法測定。水解度（degree of hydrolysis，DH）的計算見式（1）。

1.3.3 感官評價

風味的評價采用感官評價法［12-13］，從氣味、滋味兩方面按照表1擬定的標準進行感官評分，其中設(shè)置氣味的權(quán)重為30%，滋味的權(quán)重為70%，以10人評價得分的平均分量化計分。

表1 感官評價標準表Tab.1 Sensory valuation standards

1.3.4 游離氨基酸測定

使用高效液相色譜儀測定游離氨基酸含量。

色譜條件4.0 mm×125 mm C18柱，柱溫40℃，緩沖液流速1.0 mL/min，流動相A是C（醋酸鈉）= 20 mmol溶液，B是V（C（醋酸鈉）=20 mmol溶液）∶V（甲醇）∶V（乙腈）=1∶2∶2，檢測波長338 nm。

1.3.5 揮發(fā)性風味成分測定

樣品前處理是取8 mL樣品置于15 mL頂空瓶中，將老化后的75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50℃水浴中吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后立即插入氣相色譜進樣口，于250℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

GC-MS分析測定條件中色譜條件HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250℃，熱解析10 min；程序升溫是初始溫度40℃，保持2 min，以8℃/min升溫至250℃，保持10 min；載氣：He，流量0.8 mL/min，不分流。質(zhì)譜條件為電離化方式為離子轟擊（electron impact，EI），發(fā)射電流為200 A，電子能量為70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度250℃，檢測器電壓350 V，采集的質(zhì)量范圍m/z 33～454 u。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均用“平均值±標準偏差”表示，n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的選擇及其水解條件的優(yōu)化

為篩選紫菜蛋白水解的適宜蛋白酶，選取中性蛋白酶、風味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、自配復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶等5種蛋白酶，在各自的適宜條件下（其中蛋白酶的加酶量為足量加入）分別水解紫菜蛋白，以水解度和感官評價等2項指標綜合評價蛋白酶的水解效果，篩選蛋白酶。5種酶的水解條件見表2，結(jié)果見圖1。

表2 5種酶的水解條件Tab.2 Optimum hydrolysis conditions of five kinds of enzymes

自配復(fù)合蛋白酶按照m（果膠酶）∶m（纖維素酶）∶m（木瓜蛋白酶）=1∶3∶1配制

圖1 酶的種類對水解效果的影響Fig.1 Effects of different enzymes on hydrolysis

由圖1可見，比較不同蛋白酶水解后得到酶解液的水解度測定結(jié)果與感官評價結(jié)果，風味蛋白酶酶解液不僅水解度較高，而且感官評分高于其他酶，按照水解度和感官評分各50%權(quán)重計算，其綜合評分較高，因此，選擇風味蛋白酶作為紫菜水解用酶。為進一步確定風味蛋白酶水解紫菜蛋白的較優(yōu)工藝條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化風味蛋白酶的水解條件，以確定酶解的較佳條件。經(jīng)正交試驗并通過3次較佳條件的驗證試驗后，得到優(yōu)化后的酶解工藝條件為溫度55℃，時間3 h，加酶量3%。

2.2 美拉德反應(yīng)工藝條件

將紫菜酶解液中加入谷氨酸1 mg/mL，甘氨酸0.5 mg/mL，半胱氨酸0.15 mg/mL，木糖8 mg/mL，葡萄糖4 mg/mL，硫胺素0.4 mg/mL。采用Design Expert 8.0軟件Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化美拉德反應(yīng)的溫度、時間、pH值等反應(yīng)條件，試驗結(jié)果與方差分析分別見表3和表4。

由表4可知，模型顯著、失擬項不顯著，表明試驗分析有效。得到的美拉德反應(yīng)的較佳工藝條件為溫度110℃，時間50 min，pH6，預(yù)測值為7.75，驗證試驗感官評分為7.25，與預(yù)測值相對偏差6.25%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件具有實際應(yīng)用價值。

2.3 氨基酸組分分析結(jié)果

為了衡量蛋白酶的水解效果以及美拉德反應(yīng)前后氨基酸含量的變化，分別分析了紫菜水浸液、風味蛋白酶水解后的酶解液和紫菜MRPs液等各自游離氨基酸含量，以說明產(chǎn)品制備過程中氨基酸類呈味成分含量變化情況，結(jié)果見表5。

表3 響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果Tab.3 Design and results of the response surface method

表4 方差分析表Tab.4 Analysis of variance for regression model

由表5可見，風味蛋白酶水解后，游離氨基酸總量由90.18 mg/100 mL增加到122.87 mg/100 mL，增幅為36.25%。除蘇氨酸外其余各氨基酸均較酶解前有所增加，其中丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等鮮味氨基酸的含量最高且增幅也較大，分別增加了40.97%，40.85%和38.59%，這幾種呈現(xiàn)鮮味、甜味的氨基酸為獲得海鮮風味香精奠定了良好的基礎(chǔ)。為了獲得風味較佳的產(chǎn)品并為美拉德反應(yīng)提供含硫化合物［14］，在進行美拉德反應(yīng)時需要在酶解液中添加谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸等3種氨基酸。由表5可知，美拉德反應(yīng)消耗最多的為谷氨酸，其次為甘氨酸和半胱氨酸，精氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸等都有不同程度的消耗，說明參與美拉德反應(yīng)的氨基酸較多，十分復(fù)雜。谷氨酸、甘氨酸均為鮮味氨基酸，尤其是谷氨酸為呈鮮味的特征性氨基酸，甘氨酸為呈甘甜味的特征性氨基酸［15］，因此，在美拉德反應(yīng)參與物中添加適量的上述氨基酸對產(chǎn)品得以保持和增強濃郁的海鮮風味十分必要。

表5 產(chǎn)品制備過程中氨基酸含量變化Tab.5 Change of amino acids during product process

2.4 揮發(fā)性風味成分的GC-MS分析

將紫菜MRPs溶液進行GC-MS分析，以獲得風味成分的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。經(jīng)GC-MS分離鑒定出的紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分總離子流色譜如圖2。經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分的分析結(jié)果見表6。

圖2 MRPs揮發(fā)性風味成分GC-MS總離子流Fig.2 GC-MS chromatogram of MRPs

由圖2可以看出，紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分可以得到有效分離，色譜峰出峰時間集中在1～26 min之間。經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分共41種（表6），由于有少量物質(zhì)未能被定性，因此按照面積歸一法求得揮發(fā)性成分占有效總揮發(fā)性成分的百分比為89.63%。對鑒定出的紫菜MRPs中揮發(fā)性風味成分進行歸類分析，發(fā)現(xiàn)醛類含量最高，為35.71%（14種），其他類型化合物含量分別為醇類19.31%（9種），酮類17.71%（9種），烯、烷、炔等烴類化合物7.99%（6種），酯類5.10%（1種），胺類2.98%（1種），吡嗪類0.83%（1種）。從揮發(fā)性風味成分中檢出的相對含量較高的有機物依次為己醛13.32%（水果香味），1-辛烯-3-醇7.42%，4-（2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯）-3-丁烯-2-酮5.18%，4-（2，6，6-三甲基-1-環(huán)己烯）-3-丁烯-2-酮5.17%，1，2-苯二甲酸二乙酯5.10%，戊醛4.15%，苯甲醛3.61%，1-甲基環(huán)庚醇3.08%，壬醛3.06%，2-戊胺2.98%，2-甲基-3-辛酮2.74%，2，2，6-三甲基-1-甲氧基環(huán)己烷2.49%，2-己烯醛2.16%，3-甲基丁醛2.13%，辛醛2.02%等。

表6 MRPs揮發(fā)性風味成分的GC-MS分析結(jié)果Tab.6 Analysis of volatile flavor components in MRPs by GC-MS

小分子揮發(fā)性有機物對紫菜MRPs風味的形成影響較大。揮發(fā)性羰基化合物產(chǎn)生原生的、濃郁的香味，而揮發(fā)性醇類則產(chǎn)生品質(zhì)較為柔和的氣味［16］。一般來說，羰基化合物的閾值較低，對氣味的貢獻較大，這些醛酮類物質(zhì)通常被認為是藻類特征性風味的主要貢獻者［17］。酮類一般由不飽和脂肪酸熱氧化或降解產(chǎn)生，含有7～12個C原子的酮是一些天然物質(zhì)的香氣成分，分子量較大的不飽和酮類化合物具有花香味，碳鏈越長其散發(fā)的特征花香味越強烈。在紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分中，酮類化合物的碳鏈數(shù)均大于8，本產(chǎn)品散發(fā)出的清醇香氣可能與其相關(guān)［18-19］。醇類的閾值相對較高，只有高含量的醇類才會對氣味產(chǎn)生較大影響，如表6 中7.42%的1-辛烯-3-醇。烴類的閾值更高，在紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分中的含量也較少，共6種占7.99%，因此對風味的貢獻最小。被認為具有魚腥味和金屬味并構(gòu)成紫菜鮮腥氣味的2，4-庚二烯醛，在紫菜原藻中含量較多［20］，但在紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分中并未被檢測出，說明經(jīng)過美拉德反應(yīng)之后，紫菜原有的鮮腥味降低，這與產(chǎn)品制備過程中對其進行的感官鑒評結(jié)果是一致的。

此外，由表6可見，在本研究的分析測定條件下，紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分中未檢測出丙烯酰胺、呋喃、糠醛等有毒有害物質(zhì)，而上述物質(zhì)恰是美拉德反應(yīng)容易生成物［21］，這一檢測結(jié)果表明本產(chǎn)品制備過程中美拉德反應(yīng)技術(shù)合理、反應(yīng)條件控制得當，產(chǎn)品是安全的。

2.5 紫菜風味香精的質(zhì)量標準

本制備工藝得到的紫菜風味香精感官指標：色澤為暗紅色粉末，具有紫菜固有的清香，鮮味明顯，略有肉香味與果香味，無肉眼可見雜質(zhì)。食品安全性指標（重金屬）測定結(jié)果為無機砷0.35 mg/kg，鉛0.42 mg/kg，鎘0.25 mg/kg，甲基汞0.06 mg/kg，均符合有關(guān)國家標準的規(guī)定。

微生物指標中菌落總數(shù)、大腸菌群等微生物指標控制在國家標準規(guī)定范圍內(nèi)，沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌等致病菌不得檢出。

3 結(jié)論

通過對中性蛋白酶、風味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、自配復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶等5種蛋白酶不同水解效果的分析表明，風味蛋白酶水解紫菜效果最好，因此選擇風味蛋白酶作為紫菜水解用酶。經(jīng)過優(yōu)化后的風味蛋白酶的水解條件為溫度55℃，時間3 h，加酶量3%。為制備風味良好的紫菜風味香精，用此酶解液并添加氨基酸、糖類等物質(zhì)進行美拉德反應(yīng)，添加物為谷氨酸1 mg/mL，甘氨酸0.5 mg/mL，半胱氨酸0.15 mg/mL，木糖8 mg/mL，葡萄糖4 mg/mL，硫胺素0.4 mg/mL，采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件為溫度110℃，pH6，時間50 min。氨基酸組成分析顯示，酶解后大多數(shù)氨基酸組分含量明顯增加，其中丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等鮮甜味氨基酸的增幅較大，這些呈鮮味、甜味的氨基酸為獲得海鮮風味香精奠定了基礎(chǔ)。參與美拉德反應(yīng)的氨基酸主要有甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等，多種氨基酸參與了美拉德反應(yīng)且消耗量較大。GC-MS對紫菜MRPs揮發(fā)性風味成分分析鑒定結(jié)果表明，總揮發(fā)性有機物共41種，醛類、醇類、酮類、烴類、酯類等物質(zhì)含量較高，分別為35.71%，19.31%，17.71%，7.99%，5.10%，醛酮等羰基化合物含量最高，醇類次之，這2類風味物質(zhì)所具有的獨特風味對紫菜風味香精良好風味的形成起到了重要作用。此外，紫菜原藻中含有的鮮腥風味物質(zhì)未被檢測出，也未檢測出有毒有害物質(zhì)。增加鮮香味、減少腥味的產(chǎn)品制備目的已達到。

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Preparation and Flavor Component Analysis of Porphyra yezoensis Flavor Essence

YAO Xingcun，QIU Chunjiang，LAI Xiaoyan
（School of Marine Science and Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China）

The enzymatic hydrolysis of laver and preparation technology of seafood flavor were studied using Porphyra yezoensis as raw materials.By comparing the hydrolyzing ability of different enzymes and the flavor of hydrolyzates，the best enzyme was screened.The hydrolysis conditions were optimized through the orthogonal experiments using the degree of hydrolysis and sensory evaluation as the reference standard.The optimum hydrolysis conditions were temperature 55℃，time 3 h，and the addition of enzyme 3%.Then the hydrolyzate was used to make seafood flavor by the Maillard reaction.With the sensory evaluation as the reference standard，the optimum formulations and optimum conditions of the Maillard reaction were determined through response surface experiments：glutamate 1 mg/mL，glycine 0.5 mg/mL，cysteine 0.15 mg/mL，xylose 8 mg/mL，glucose 4 mg/mL，thiamine 0.4 mg/mL，the reaction temperature 110℃，pH6，and the time 50 min.The product showed fine seafood flavor and the flavor was evident.The amino acid composition analysis showed that glutamate and alanine contents were significantly increased in the hydrolyzate.The amino acids in the Maillard reaction were mainly glycine，glutamic，and cystine.About 41 volatile organic components were detected by GC-MS.

Porphyra yezoensis UEDA；enzymatic hydrolysis；Maillard reaction；flavor essence

李 寧）

TS254.4

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.03.006

2095-6002（2015）03-0028-07

姚興存，邱春江，賴小燕.紫菜風味香精的制備及其風味成分分析［J］.食品科學技術(shù)學報，2015，33（3）：28-34.

YAO Xingcun，QIU Chunjiang，LAI Xiaoyan.Preparation and flavor component analysis of Porphyra yezoensis flavor essence［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（3）：28-34.

2014-07-22

江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目。

姚興存，男，教授，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究。